基于网络药理学的多叶棘豆总黄酮抗炎作用机制研究

杨立国，郝俊生 ，萨其拉吐 ，苏都那布其，王秀兰

（1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028043；
2.内蒙古蒙医药工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000；
3.通辽市食品药品检验所，内蒙古 通辽 028000）

多叶棘豆为豆科植物多叶棘豆Oxytropis myriophylla 的干燥全草，味苦、甘，性凉、钝、轻、糙，具有杀“粘”、清热、燥“协日乌素”等功效，临床上用于瘟疫、发症、丹毒等症，在历代蒙、藏医籍中均有记载，为蒙、藏医临床常用药［1］。多叶棘豆作为蒙药最早收载于蒙古族医学专著《认药白晶鉴》中，具有杀“粘”、消肿、解毒的功效，在巴特日七味丸、清感九味丸、额日敦-嘎日迪等蒙药复方制剂中广泛应用［2］。几十年来，中外学者对蒙药多叶棘豆的化学组成进行了深入的研究，发现多叶棘豆主要含有黄酮类成分［3-12］。现代药理学研究表明，棘豆属植物大多具有抗炎的功效［13］。然而，虽然多叶棘豆在蒙医临床上已应用多年，但多叶棘豆总黄酮抗炎作用机制仍不明确。网络药理学从蒙药多成分、多靶点的特点出发，整体上分析阐述蒙药的作用机制，利于推进蒙药作用机制的深入研究［14］。为了深入探讨多叶棘豆总黄酮类成分抗炎药效机理，笔者拟通过网络药理学方法和技术，预测蒙药多叶棘豆总黄酮类成分发挥抗炎药效的靶点和通路，进而阐明蒙药多叶棘豆总黄酮类成分抗炎作用机制。

1.1 材料

本研究使用的数据库、研究平台等详见表1。

表1 网络药理学研究使用的数据库和平台Tab. 1 Databases and platforms for network pharmacology research

1.2 多叶棘豆黄酮类成分收集与活性成分筛选

经Scifinder和中国知网检索多叶棘豆化学成分相关中英文文献，总结国内外学者从多叶棘豆中分离鉴定出的黄酮类化学成分，再以Swiss ADME中Bioavailability Score参数对上述黄酮类化学成分进行筛选得到潜在活性成分。

1.3 多叶棘豆黄酮类活性成分靶点预测

通过PubChem 数据库检索上述活性成分，将活性成分二维结构Canonical SMILES 格式文件导入Swiss Target Prediction数据库，设置物种为Homo sapiens，预测活性成分的潜在靶点，删除Probability值为0的靶点。

1.4 多叶棘豆抗炎作用靶点的收集

通过GeneCards数据库检索炎症相关靶点，输入关键词为inflammation，设置物种为Homo sapiens，筛选score评分大于10的靶点。将多叶棘豆黄酮类活性成分潜在靶点与炎症相关靶点取交集，得到多叶棘豆抗炎作用靶点。

1.5 核心靶点PPI网络的构建

将交集靶点导入String数据库，设置分析生物体为Homo Sapiens，置信度得分设置为0.9后进行分析并保存数据（TSV 文件）。将上述文件导至Cytoscape 3.9.1 软件，通过Network analyzer 模块分析，构建蒙药多叶棘豆黄酮类成分发挥抗炎药效的核心靶点网络。

1.6 GO、KEGG通路富集分析

将交集靶点导至DAVID数据库，设置相关参数，得到GO和KEGG信号通路。

1.7 蒙药-成分-靶点-疾病网络的构建

将蒙药多叶棘豆的成分、靶点、疾病数据导入Cytoscape 3.9.1软件，通过Merge工具构建蒙药-成分-靶点-疾病网络。

2.1 多叶棘豆黄酮类活性成分

经文献检索、总结后发现，从多叶棘豆中共分离得到黄酮类化学成分43个［3］，以Swiss ADME中Bioavail⁃ability Score参数筛选后得到24个活性成分，其有机小分子生物活性数据库编号、名称和生物利用度分值详见表2。

表2 多叶棘豆黄酮类活性成分Tab. 2 Active flavonoids from Oxytropis myriophylla

2.2 多叶棘豆黄酮类活性成分的靶点

对多叶棘豆中24个黄酮类活性成分进行靶点预测，得到化合物1共21个靶点、化合物2共7个靶点、化合物3共101个靶点、化合物4共104个靶点、化合物5共22个靶点、化合物6共21个靶点、化合物7共109个靶点、化合物8共112个靶点、化合物9共127个靶点、化合物10共40个靶点、化合物11共40个靶点、化合物12共119个靶点、化合物13共67个靶点、化合物14共136个靶点、化合物15共34个靶点、化合物16共45个靶点、化合物17共120个靶点、化合物18共20个靶点、化合物19共114个靶点、化合物20共42个靶点、化合物21共134个靶点、化合物22共101个靶点、化合物23共108个靶点、化合物24共45个靶点，删除重复靶点，共得到350个有效靶点。

2.3 多叶棘豆抗炎药效靶点

采用GeneCards数据库搜索炎症靶点，得到评分大于10的靶点93个。将2.2中多叶棘豆黄酮类活性成分350个有效靶点与上述93个靶点取交集，得到18个多叶棘豆总黄酮抗炎作用靶点，见图1和表3。

图1 多叶棘豆总黄酮抗炎作用靶点韦恩图Fig. 1 Venn diagram of anti-inflammatory targets of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

表3 多叶棘豆总黄酮抗炎作用靶点信息Tab. 3 Anti-inflammatory targets information of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

2.4 PPI网络分析

PPI网络共包含18个节点，89条边，平均节点度9.89，平均局部聚类系数0.828。见图2。

图2 多叶棘豆总黄酮抗炎作用靶点PPI网络Fig. 2 PPI network of anti-inflammatory targets of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

由图2可知，PTGS2、MMP9、VEGFA、PPARG、STAT3等靶点的度值较高，说明上述靶点在PPI网络中作用显著，提示这些靶点可能在多叶棘豆总黄酮发挥抗炎作用中有重要作用。

2.5 GO、KEGG富集分析

将多叶棘豆总黄酮抗炎作用靶点上传至DAVID 平台，根据P<0.05为筛选条件，共收集到17条生物学过程（BP）条目，主要涉及血小板α颗粒腔、富含纤胶凝蛋白1颗粒腔、细胞表面、胞外空间、大分子复合物等；
26条细胞组成（CC）条目，主要涉及蛋白复合物组装的正向调节、肽基-丝氨酸磷酸化的正向调节、白细胞介素-6产生的正向调节、对乙醇的反应、对脂多糖的反应等；
16条分子功能（MF）条目，主要涉及CCR5趋化因子受体结合、氧化还原酶活性、肽链内切酶活性、蛋白磷酸酶结合、细胞因子受体结合等。根据P值，用条形图列出了BP、CC、MF前10个条目，见图3。

图3 关键靶点的生物学过程（1~10）、细胞组成（11~20）和分子功能分析（21~30）Fig. 3 Biological process（1~10），cellular component（11~20）and molecular function analysis（21~30）of key targets

将多叶棘豆总黄酮抗炎作用靶点上传至DAVID 数据库，根据P<0.05 为筛选条件，共收集到9 条KEGG信号通路，包括炎性肠病、NF-kappa B通路、TNF通路、类风湿性关节炎、Th17细胞分化、HIF-1信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎、JAK-STAT信号通路等，见图4。

图4 关键靶点KEGG通路分析Fig. 4 KEGG pathway analysis of key targets

2.6 多叶棘豆总黄酮-靶点-疾病网络构建

利用Cytoscape 3.9.1 软件绘制多叶棘豆总黄酮活性成分-作用靶点-疾病网络，见图5。图5 中长方形为药物，椭圆形为活性成分，菱形为作用靶点，六角形为疾病。按Degree值和BC值大小排序筛选核心成分和核心靶点，结果显示5，4’-dihydroxy-7，3’-dimethoxyflavone、5，7-dihydroxy-6，4’-dimethoxyfla⁃vone、apigenin、luteolin、kaempferol等为核心成分，ABCB1、PTGS2、ALOX5、SYK、NOS2等靶点为核心靶点，可以看出蒙药多叶棘豆总黄酮多成分-多靶点的作用特点。

图5 多叶棘豆总黄酮抗炎作用活性成分-关键靶点网络Fig. 5 Anti-inflammatory active components-key targets network of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

目前，临床上对炎症的治疗仍以西药治疗为主，包括使用甾体抗炎药和非甾体抗炎药，因合成药物有较强的毒副作用，越来越多的企业将抗炎药物研发重点放在中药及天然药物上［15］。蒙医药学作为中医药学的重要组成部分，是蒙古族人民在长期的生产生活实践中同疾病作斗争的经验总结，千百年来世代相传，形成了今日有系统学科的民族医药理论体系。由于内蒙古地处祖国北疆，大部分地区气候寒冷，加之蒙古族人民的游牧生活习惯，炎症性疾病是地区常见病、多发病，蒙医药在治疗该类疾病方面，积累了相当丰富的经验，许多行之有效的内服药物应用至今，为防治蒙古族人民乃至内蒙古地区其他民族人民的炎症性疾病作出了重大贡献［16-18］。多叶棘豆作为常用蒙药，广泛应用于炎症性疾病，而发挥抗炎作用的药效物质很可能是黄酮类成分［19-21］。笔者采用网络药理学的方法对多叶棘豆总黄酮发挥抗炎作用的机制进行了探索，构建了多叶棘豆黄酮类成分-靶点-炎症网络，预测了多叶棘豆总黄酮发挥抗炎作用的潜在机制。首先，从蒙药多叶棘豆黄酮类活性成分中共得到350个靶点，其中与炎症交集靶点18个，对上述18个靶点进行了GO及KEGG分析。通过18个交集靶点的GO分析可知，生物学过程、细胞组成、分子功能等均参与抗炎疗效发挥，表明多叶棘豆总黄酮可通过调控多个生物学过程来发挥抗炎作用。KEGG分析显示，核心靶点主要富集于NF-kappa B通路、TNF通路等，表明多叶棘豆总黄酮通过不同通路来治疗炎症性疾病。另外，由化学成分-靶点-疾病网络图可得排在前5 位的化学成分为5，4’-dihydroxy-7，3’-dimethoxyflavone、5，7-dihydroxy-6，4’-dimethoxyflavone、apigenin、luteolin和kaempferol等成分，排在前5位的靶点为ABCB1、PTGS2、ALOX5、SYK、NOS2等靶点。以上结果充分显示了多叶棘豆多成分、多靶点治疗炎症的作用特点，既包含蒙医药整体论治的特色，也具有现代医学精准医疗的理念，符合蒙医药现代化的方针。综上，本研究初步揭示了蒙药多叶棘豆黄酮类成分发挥抗炎作用的潜在活性成分和可能的作用机制，为进一步深入探讨多叶棘豆抗炎药效物质及其作用机制奠定了基础，然而，上述结论仅是推测，具体机制我们会通过后续细胞水平、动物试验等手段进行进一步验证。

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