鲈鱼在4℃冷藏过程中的肌肉品质变化

杨汝晴，陈玉磊,2，孙乐常,2，张凌晶,2，刘光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；
2.大连工业大学海洋食品深加工协同创新中心，辽宁 大连 116034）

鱼类是优质蛋白的重要来源，营养价值较高。鱼骨骼肌由肌隔膜分开的肌节重叠而形成[1]，这一独特的结构特征使鱼肉相较于哺乳动物和禽类动物的肌肉更加柔软，也更易被内源性蛋白酶分解[2]。哺乳动物宰杀后的肌肉软化可以提高肉的嫩度，并改善肉的品质[3]。然而，鱼类等水产品在宰后低温贮藏期间软化的时间短，易发生微生物腐败而导致品质降低[4-7]。

鱼的肌肉硬度因贮藏过程中结缔组织结构的改变而降低。在鱼肌肉的结缔组织中，胶原蛋白是重要的组成部分，胶原蛋白对维持鱼肉的完整性和肌肉的黏结性起着至关重要的作用[8]，胶原蛋白的降解也是导致肌肉软化的一个重要因素[9]。通常，胶原蛋白被认为是一种相对稳定的蛋白质，在冷藏过程中，胶原原纤维由于内源性胶原酶的作用导致其与肌纤维之间出现缝隙，其他非特异性蛋白酶进一步降解引起肌肉品质的劣化[4]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）属于锌依赖内肽酶超家族，在组织重塑、转换和生长过程中参与胞外基质成分的新陈代谢。MMPs主要由成纤维细胞作为前酶合成和分泌，胶原酶（MMP-1、MMP-8和MMP-13）被激活后对胶原蛋白进行初始切割，随后明胶酶（MMP-2和MMP-9）进一步参与降解[10]。在鱼类中，MMPs通过水解胶原蛋白从而导致鱼类肌肉质构品质的下降[11]。

鲈鱼（Lateolabrax japonicus）学名日本真鲈，其肉质细腻鲜美、少有鱼骨，因丰富的营养价值和独特的风味受到消费者的广泛欢迎。2020年，我国海水养殖鲈鱼产量达19.2万 t，在养殖海水鱼中位居第二[12]。目前，国内外对鲈鱼的研究主要集中在利用保鲜技术延长货架期方面[5,13]，而对于鲈鱼肌肉蛋白在贮藏过程中的生化变化关注较少。通过研究鲈鱼在冷藏过程中的品质变化，有利于揭示其规律，为建立科学的鲈鱼保鲜方法提供理论依据。因此，本研究以鲈鱼为研究对象，探讨其在4 ℃冷藏条件下理化性质、质构、MMPs活力等指标的变化，利用免疫组织化学技术分析冷藏过程中I型胶原蛋白的变化，旨在为了解鲈鱼在冷藏条件下的品质变化机理提供一定的理论参考。

1.1 材料与试剂

鲜活鲈鱼购于厦门市集美菜市场，体质量（1.26f 0.34）kg、体长（32.92f 5.23）cm。

平板计数琼脂培养基 广东环凯微生物科技有限公司；
Masson染色套装、兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体、免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液 武汉赛维尔生物科技有限公司；
MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2荧光底物 日本Peptide Institute公司；
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 青岛福林生物化学公司；
其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PT-2100组织捣碎机 瑞士Kinematica公司；
Avanti J-26SXP高速冷冻离心机 美国Beckman公司；
ATN-300全自动凯氏定氮仪 鹤壁市大德实验设备有限公司；
DS-CHN100 E100正置光学显微镜、DS-U3成像系统日本尼康公司；
Starter 3100 pH计 美国Ohaus公司；
TA.XT Plus/50质构仪 英国SMS公司；
FP-8200荧光分光光度计 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 鲈鱼预处理

将鲈鱼碎冰冷却后处死，去内脏并用灭菌去离子水冲洗干净，沥干水分后装入密封袋中，于4 ℃冷库贮藏12 d，每2 d相同时间点取样进行各项指标测定。

1.3.2 pH值的测定

参照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》，取5 g鱼肉，加入25 mL煮沸后冷却的蒸馏水，组织捣碎，静置30 min后，4 ℃、15000hg离心5 min，用pH计测定上清液的pH值。

1.3.3 菌落总数的测定

参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数的测定》，取1 g鱼肉，加入9 g生理盐水，捣碎，再按体积比1∶10进行稀释，在培养皿中加入1 mL稀释液，然后倒入平板计数琼脂培养基，混匀，凝固，然后于（30f 1）℃培养箱中倒置培养48 h，计算菌落总数，结果以lg（CFU/g）表示。

1.3.4 总挥发性盐基氮含量的测定

参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》，取5 g不同冷藏时间的鲈鱼鱼肉，加入100 mL煮沸后冷却的蒸馏水，组织捣碎，静置30 min后，4 ℃、15000hg离心30 min，滤纸过滤。吸取滤液10.0 mL于消化管中，加入10 mL 1 g/100 mL MgCl2溶液，20 mL硼酸为吸收液，蒸馏5 min，用0.01 mol/L盐酸标准滴定溶液进行滴定。用10 mL蒸馏水作空白对照。总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量按式（1）计算。

式中：X表示TVB-N含量/（mg/100 g）；
V1、V2分别表示试样和空白消耗的盐酸标准滴定溶液体积/mL；
c表示盐酸标准滴定溶液浓度/（mol/L）；
m表示试样质量/g；
14表示滴定1 mL标准试样相当于氮的摩尔质量/（g/mol）；
100为单位换算系数。

1.3.5K值的测定

根据SC/T 3048-2014《鱼类鲜度指标K值的测定 高效液相色谱法》和闵娟等[14]的方法，并略作修改。取1 g鱼肉，加入5 mL体积分数10%高氯酸溶液，4 ℃、15000hg下离心15 min，取上清液。沉淀物中加入4.5 mL体积分数5%高氯酸溶液，混匀，再次离心15 min，重复2 次。用NaOH溶液调上清液pH值至6.0～6.4，整个过程在冰上进行。再次离心，沉淀加入8 mL 5%高氯酸-氢氧化钾中性液，离心，合并上清液，用超纯水定容至25 mL，过0.22 μm水系膜后用于K值测定。

高效液相色谱条件[14]：色谱柱SHODEX Asahipak GS-320 HQ（7.5 mmh 300 mm）；
流动相为205 mmol/L NaH2PO4-205 mmol/L H3PO4（300∶7，V/V）；
流速0.6 mL/min；
柱温30 ℃；
检测波长260 nm；
进样量20 μL。K值按式（2）计算。

式中：CATP、CADP、CAMP、CIMP、CHxR、CHx分别为三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤含量/（μmol/g）。

1.3.6 质构特性的测定

取贮藏不同时间鲈鱼骨骼肌，剪切成长、宽、高均为1.5 cm的鱼块，采用质构仪测定硬度。测定条件：平底柱形探头P/6、测试速率1 mm/s、压缩程度60%、接触力5.0 gf。平行测定3 次。

1.3.7 Masson染色

肌肉组织经过固定液固定、石蜡包埋和蜡块修整，将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片。将厚度3～4 μm的石蜡切片脱蜡至水，采用Masson复合染色液进行染色，随后切片用1%冰醋酸漂洗分化，乙醇脱水，中性树胶封片，用显微镜进行镜检并采集图像分析。该项工作委托武汉赛维尔生物科技有限公司完成。

1.3.8 I型胶原免疫组化分析

将组织切片置于抗原修复缓冲液中进行抗原修复，切片放入体积分数3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，在脱色摇床上晃动洗涤，在组化圈内滴加3%牛血清白蛋白溶液均匀覆盖组织，室温封闭30 min。轻轻甩掉封闭液，加入兔抗鼠I型胶原一抗，4 ℃孵育过夜。然后加入二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白G）室温孵育50 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，胶原阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。再用苏木素复染3 min，自来水冲洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，自来水冲洗。脱水，中性树胶封片，显微镜镜检并采集图像分析。该项工作委托武汉赛维尔生物科技有限公司完成。

1.3.9 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

取不同贮藏时间鲈鱼肌肉样品，加入4 倍体积Tris-HCl缓冲液（20 mmol/L、pH 8.0），均质，加入2 倍体积的蛋白溶解液（含20 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、1%十二烷基硫酸钠、2%β-巯基乙醇，pH 8.0），95 ℃加热20 min，于－20 ℃贮藏备用。待样品全部制备完成，采用丙烯酰胺质量分数为8%的分离胶和5%的浓缩胶对样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）。利用Image J软件进行光密度分析。蛋白降解比例按式（3）计算。

式中：ODn为贮藏第n天样品蛋白电泳条带光密度值；
OD0为贮藏第0天样品蛋白电泳条带光密度值。

1.3.10 MMPs活力测定

取5 g鱼肉，置于4 倍体积的Buffer A（含20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L CaCl2，pH 8.0）中充分捣碎，4 ℃、15000hg离心20 min制备粗酶液。根据Knight等[15]的方法，在850 μL Buffer A中加入100 μL粗酶液，再加入50 μL浓度为10 μmol/L的荧光底物（MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2）。在35 ℃下反应30 min，加入1.5 mL终止液（甲醇-异丙醇-蒸馏水（35∶30∶35，V/V））。用荧光分光光度计在328 nm激发波长和393 nm发射波长下测定释放的MOCAc-Pro-Leu-Gly荧光强度。MMPs活力单位定义为每分钟释放1 nmol MOCAc-Pro-Leu-Gly的量。以0 d鱼肉中的MMPs活力为100%，计算相对活力。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 18.0软件进行数据分析，所有实验均重复3 次。采用Origin 8.0软件绘图。图片采用Adobe Illustrator CS5软件进行标注。

2.1 鲈鱼冷藏过程中肌肉理化性质变化

如图1A所示，鲈鱼肌肉的初始pH值为7.01，在贮藏初期，由于糖原和ATP的分解，pH值逐步降低至6.82。随贮藏时间的延长，蛋白质分解产生碱性含氮物质，从而导致pH值升高[5]，贮藏至第12天，鲈鱼肌肉pH值为7.43。TVB-N含量被广泛用于评价鱼类的新鲜度，大多数新鲜海洋鱼类的可接受TVB-N含量限度为30 mg/100 g。本研究结果显示，TVB-N含量在鲈鱼4 ℃贮藏4 d后明显增加，并在第8天超过限值（图1B）。挥发性碱性化合物主要由腐败微生物代谢蛋白质产生，因此菌落总数是评价鱼肉质量的重要指标。鲜鱼可接受的菌落总数临界值为6.0（lg（CFU/g））[16]。通常，冷藏一段时间的鱼肉仍可保持其新鲜度，但是低温不能完全抑制微生物的生长。新鲜鱼肉的初始菌落总数为3.33（lg（CFU/g）），随着贮藏时间的延长，第6天和第8天时菌落总数分别达到5.47（lg（CFU/g））和6.35（lg（CFU/g））（图1C），第8天超过临界值。K值是反映鱼肉新鲜度的重要生化指标，K值越低新鲜度越高。如图1D所示，新鲜鲈鱼的K值为6.76%，随冷藏时间延长K值逐渐增加，在第8天达67.71%，超过60%的可接受值[17]。通过对鲈鱼冷藏期间的TVB-N含量、菌落总数以及K值等指标进行综合评价，得出4 ℃冷藏条件下，鲈鱼的最佳贮藏期为8 d以内。

图1 4℃冷藏期间鲈鱼肌肉理化性质的变化Fig.1 Changes in physicochemical properties of Lateolabrax japonicus muscle during cold storage at 4℃

2.2 鲈鱼冷藏过程中肌肉总蛋白SDS-PAGE分析结果

如图2A所示，在贮藏6 d以内，鲈鱼肌肉中的肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）和肌动蛋白没有发生明显变化。随贮藏时间进一步延长，MHC逐渐降解为150 kDa左右，但肌动蛋白未发生明显降解。光密度值分析结果显示，在贮藏6 d以内，MHC降解比例为10%以下，而当贮藏时间至第8天时，约32%的MHC发生降解，至第12天时降解比例达50%。肌动蛋白在整个贮藏过程中降解均不明显（图2B）。因此，低温贮藏前期鲈鱼肌肉蛋白组成基本稳定，贮藏后期MHC发生明显降解。

图2 4℃冷藏过程中鲈鱼肌肉蛋白降解的SDS-PAGE图（A）及光密度分析结果（B）Fig.2 SDS-PAGE (A) pattern and optical density analysis result (B) of proteins in the muscle of Lateolabrax japonicus during cold storage at 4℃

2.3 鲈鱼冷藏过程中肌肉组织形态的变化

骨骼肌主要由肌原纤维和结缔组织组成，结缔组织对肌肉组织的完整性和机械支撑有重要作用。为了分析贮藏期间鲈鱼肌肉微观结构变化，对在4 ℃下分别放置0、2、6、12 d的鲈鱼肌肉进行Masson染色，检测肌肉组织形态学变化情况。由图3可知，Masson染色法较好地区分了肌原纤维和胶原纤维，其中肌原纤维呈红色，而胶原纤维呈蓝色。贮藏初期（0～2 d），鲈鱼背部肌肉纤维排列紧密，结构完整，纤维间隙均匀（图3A、B）；
贮藏至第6天，细胞间隙增大，肌内膜变细，肌纤维变得疏松（图3C）；
贮藏至第12天，包裹肌纤维的肌膜降解，肌纤维明显断裂，组织结构变得模糊（图3D）。

图3 Masson染色分析4℃冷藏过程中鲈鱼肌肉形态的变化Fig.3 Morphological changes of Lateolabrax japonicus muscle during cold storage at 4℃ evaluated by Masson staining

2.4 I型胶原蛋白的免疫组化分析结果

肌膜主要由I型胶原构成，肌内膜是由I型胶原与少量III型胶原共同构成。为了更好地分析冷藏过程中I型胶原的分布以及变化情况，采用免疫组织化学染色标记肌肉组织中的I型胶原。免疫反应采用DAB显色液使胶原阳性区域呈现棕黄色。由图4可知，鱼肉中I型胶原主要存在于肌纤维缝隙的肌内膜和包裹着肌纤维的肌膜。肌内膜提供强大抗拉功能并呈现一定规律的网状结构，肌膜对肌纤维结构的完整性起支撑作用且呈现有序的平行排列。在新鲜状态下（0 d），结缔组织中的肌内膜显色明显，包裹肌纤维的肌膜略有显色（图4A）。贮藏至第2天，肌膜显色逐渐清晰，可能是肌膜与肌纤维开始解离，胶原蛋白更多外露，与抗体反应的比表面积增加从而导致颜色加深。当冷藏至第6天，肌膜显色进一步加深，表明肌膜与肌纤维间的紧密结合程度减弱（图4C）。当贮藏至第12天，肌膜与肌纤维发生明显分离，肌纤维的紧密结构被破坏（图4D）。因此，冷藏期间鱼肉结缔组织中的I型胶原蛋白发生了明显分解。

图4 免疫组化分析4℃冷藏过程中I型胶原蛋白的变化Fig.4 Immuno-histochemical analysis of changes in type I collagen during cold storage at 4℃

2.5 鲈鱼冷藏过程中肌肉硬度和MMPs活力的变化

如图5所示，贮藏初期，鲈鱼肌肉硬度呈现先上升后下降趋势，贮藏2 d后，随着贮藏时间的延长而逐渐降低。研究发现，蛋白酶对胶原蛋白的降解与鱼肉弹性的下降密切相关，因此鱼肉中内源性蛋白酶被认为是导致鱼肉变软的重要原因。其中，MMPs主要参与胞外基质的降解与重塑，能够分解鱼体肌肉中不同类型的胶原蛋白[11]。采用荧光肽底物对贮藏期间鲈鱼肌肉中MMPs活力进行分析，结果如图5所示。在新鲜状态下能检测到MMPs活力，冷藏期间MMPs活力持续增强，12 d约为初始酶活力的2 倍。正常生理条件下，MMPs以酶原的形式分泌到胞外，并通过激活途径产生有活性的酶，参与胞外基质的降解与重塑[10]。鲈鱼在4 ℃贮藏过程中，无活性的MMPs酶原被激活产生更多活性酶，从而参与鱼死后肌肉软化过程。

图5 鲈鱼4℃冷藏期间肌肉硬度和MMPs活力的变化Fig.5 Changes in hardness and MMPs activity of Lateolabrax japonicus muscle during cold storage at 4℃

鱼死后会发生僵直、自溶、腐败等一系列生化变化。在此过程中，蛋白质降解导致肌肉结构被破坏，从而使鱼的品质降低[18-19]。低温贮藏是控制鱼类品质下降的常用方法。虽然低温贮藏一定程度降低了蛋白酶的活力，抑制了微生物的生长，但由于反应的不可逆性，鲜度降低与品质劣化仍不可避免[20]。肌肉pH值是鱼类鲜度变化的一项评价指标。新鲜鲈鱼肌肉pH值接近中性，贮藏0～2 d，pH值逐步降低，pH值的轻微下降是由于ATP及其代谢物分解释放氢离子的积累[2]。随着鱼体进入僵后阶段，蛋白质、脂类和碳水化合物通过自溶和微生物分解而产生的氨基酸和含氮化合物，导致肌肉pH值增加[5]，而这些氨基酸和含氮化合物为腐败菌繁殖提供了基质。大多数新鲜海洋鱼类菌落总数和TVB-N含量的可接受性限值分别为6（lg（CFU/g））和30 mg/100 g，低温贮藏至第8天，鲈鱼的菌落总数和TVB-N含量超过限值。鲈鱼的TVB-N含量随着微生物的生长而进一步增加，表明TVB-N主要由腐败微生物的代谢活动产生[2]。K值是评估鱼类新鲜度的重要指标，ATP分解产生与K值相关的系列产物。鱼肉的自溶作用和酶促反应导致ATP在冷藏过程中加速降解，因此K值的增加与鱼肉新鲜度降低有关[21]。

在鱼类骨骼肌中，肌原纤维蛋白虽然是其主要成分，但肌内膜和肌膜等结缔组织对维持肌肉的完整性和肌肉的力学性能具有重要作用。Sato等[22]利用电子显微镜观察冷藏后软化的沙丁鱼肌肉组织，发现鱼肉结缔组织变薄，而肌原纤维的结构仍较为完整。本研究结果表明，虽然4 ℃贮藏初期（2～4 d）鲈鱼的pH值和肌肉硬度有所降低，但肌原纤维蛋白中的重要组成蛋白MHC和肌动蛋白无明显变化。通过Masson染色发现，新鲜的鲈鱼背部肌肉组织排列紧密良好、结构完整，随着贮藏时间延长至第6天，肌内膜发生降解，细胞间隙增大，肌原纤维更易被内源性蛋白酶降解产生含氮化合物，使pH值逐渐升高，为腐败菌繁殖提供有利条件，随后菌落总数和TVB-N含量逐渐增加。鱼肉的肌内膜和肌膜主要组成成分为I型胶原。贮藏至12 d时，鲈鱼肌肉结缔组织中肌膜显著降解，肌纤维明显断裂，组织结构变得模糊。以上结果表明，结缔组织蛋白的降解是鱼类软化的重要因素[23]。胶原蛋白作为结缔组织的重要组成成分，对鱼肉的硬度和结构维持起重要作用[24]。

鱼肉质地对鱼的新鲜度、品质评价有重要影响。贮藏2 d后，鲈鱼肌肉的硬度随着贮藏时间的延长而逐渐降低。Kubota等[25]对活体牙鲆注射蛋白酶抑制剂，发现MMPs抑制剂能显著抑制牙鲆死后冷藏期间的肌肉软化。Suárez等[26]研究发现，真鲷肌肉冷藏期间胶原蛋白含量的减少伴随着鱼肉硬度的下降。胶原蛋白的三股螺旋构象稳定性高，可耐受多种蛋白酶的降解[27]，而MMPs是能够特异性降解胶原蛋白的内源性蛋白酶[10]。Martinez等[28]研究也发现大西洋鲑鱼软化肌肉中MMPs活力不断升高。鲈鱼在4 ℃贮藏过程中MMPs活力增加，可能是由于无活性的MMPs酶原被激活为成熟的MMPs。胶原蛋白被特异性胶原酶（MMP-1、MMP-8和MMP-13）初始切割后，结构被破坏，稳定性变差，易被明胶酶（MMP-2和MMP-9）进一步降解[29-30]。本课题组前期研究发现，鲤鱼MMP-2能降解I型和V型胶原，从而参与肌肉软化[31]。Kubota等[32]报道了牙鲆MMP-9通过降解I型胶原参与肌肉蛋白的降解。综上所述，鲈鱼在4 ℃冷藏过程中，由于内源性蛋白酶对I型胶原的降解，使其结构被破坏，肌膜与肌纤维产生间隙，导致肌纤维更易被蛋白酶分解，加快肌肉的自溶过程，影响食用品质，而I型胶原的降解是鲈鱼肌肉软化的主要因素之一。

本实验通过对4 ℃冷藏过程中鲈鱼肌肉pH值、TVB-N含量、菌落总数、K值、质构、MMPs活力等指标测定，发现鲈鱼品质在第8天超过临界值。尽管贮藏8 d后鲈鱼肌肉蛋白中肌原纤维蛋白MHC开始降解，但肌肉结缔组织中I型胶原的降解是导致肌肉软化的主要原因，而MMPs是降解I型胶原的主要酶类。

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