鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠泌乳功能的促进作用

蒋 博，汪金林，王海燕，高瑞昌，徐新星，白 帆，赵元晖,*，刘 康,*

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；
2.衢州鲟龙水产食品科技开发有限公司，浙江 衢州 324002；
3.海信家电集团股份有限公司，山东 青岛 266071；
4.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

母乳喂养被认为是世界上最好的哺乳方式。母乳具有营养全面的优势，在促进婴儿免疫系统发育方面发挥重要作用，能充分满足婴儿的生长发育需求。近年来，母乳喂养得到越来越多家庭的重视，但随着社会压力、工作节奏、生活习俗、饮食结构变化以及高龄产妇数量增加等多种因素影响，产后缺乳的症状呈逐年增高的趋势[1]。据中国发展基金会2019年的报告显示，约有40%以上的产妇存在缺乳、少乳和稀乳的症状，目前我国婴儿6 个月内纯母乳喂养率仅为29.2%[2]。

目前多数关于缺乳的治疗研究是基于中药及其相关提取物的开发和应用。Lin Man等[3]探究了槲皮素对产后缺乳模型小鼠的治疗效果及其作用机制，结果发现槲皮素可通过刺激垂体分泌催乳素（prolactin，PRL）以及乳腺中催乳素受体（prolactin receptor，PRLR）等物质，明显改善缺乳小鼠的泌乳量并提高乳汁质量；
董世起[4]研究中药催乳汤对溴隐亭致大鼠产后缺乳的保护作用，验证了催乳汤可以显著提高大鼠血清催乳素浓度。尽管中药对产后缺乳具有促进作用，但是传统中药汤剂熬制过程繁琐、加工时间长以及中药味苦等使得中药的缺乳治疗存在一定限制[5]。

PRL是由动物脑垂体合成与分泌的一种单链多肽类激素，具有促进机体生长、乳腺发育，启动和维持泌乳等多种作用[6-7]。已有文献报道鱼类脑垂体和多个渗透调节器官含有催乳素[8]，一些学者也已对罗非鱼、鲤鱼、肺鱼、鲟鱼等多种鱼类的PRL进行分离、鉴定和抗体制备等研究[9-12]。已有文献报道鲟鱼等一些软骨鱼类PRL的一级结构与哺乳动物类似，都同样含有3 个二硫键[13-14]，但目前鲜有研究探究其是否具有促进泌乳的功能。我国传统的猪蹄汤、鱼汤等为目前缺乳产妇普遍采用的催乳食疗方法。但因其成分复杂、加工方式不一，尚缺乏理论研究基础，无可靠数据支撑。

本实验精炼完善鲟鱼头汤的制作工艺，使其易于加工且产物不含药物成分，对产妇和婴儿具有一定的安全性，同时减少传统中药汤剂等繁琐的加工工序以及味苦的缺陷；
此外，利用甲磺酸溴隐亭构建产后缺乳大鼠模型[15]，以乳清蛋白鲈鱼粉灌胃母鼠为阳性对照，考察鲟鱼头汤促泌乳的功效；
进一步通过生理生化实验探讨可能的催乳机理，以期为鲟鱼头汤有效改善产后缺乳症状提供一定理论参考，并为食品催乳应用研究提供技术支撑。

1.1 动物、材料与试剂

8 周龄哺乳期雌性Wistar大鼠24 只，分娩时间相差不超过24 h，体质量（300±20）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003。

鲟鱼鱼头 杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司。

乳清蛋白鲈鱼粉 益倍健康科技（武汉）有限公司；
一抗（PRL兔单克隆抗体、β-酪蛋白（β-casein，β-CN）兔单克隆抗体） 美国Abcam公司；
二抗（辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的兔单克隆抗体）、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液、苏木素染液 武汉赛维尔生物科技有限公司；
PRL、PRLR、β-CN、α-乳清蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、乳糖合成酶（lactose synthase，LS）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 上海臻科生物科技有限公司；
RNA提取试剂、逆转录试剂、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水 南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

倒置显微镜 日本Olympus公司；
全自动酶标仪、低温高速离心机 美国赛默飞世尔科技公司；
基因扩增仪杭州朗基科学仪器有限公司；
实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；
LE2002E电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；
LGJ-10C真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；
F-50微型反压灭菌釜 山东创美机械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲟鱼头汤的制备

工艺流程：养殖→宰杀→取鲟鱼头→切割预处理→清洗蒸煮→分离漂洗→初次熬制→高压液化鱼头软骨→筛网过滤→二次熬制及调味→称量及罐装→灭菌

主要操作步骤：1）原料预处理：先将漂洗后的鱼头放入蒸箱中蒸煮，然后分离鱼头肉、脂肪和软骨，分别漂洗5 min。2）一次熬制与高压液化：将（鱼头肉＋脂肪）与水按质量比1∶1.5熬制成肉糜状态，过200 目筛网；
将鱼头软骨与水按质量比1∶1.5加入微型反压灭菌釜，并按照灭菌釜的通用参数设置，通过热处理使原料充分压化至液态，过200 目筛网。3）产品的二次熬制：将过滤好的鱼头肉和脂肪等的汤汁与过滤好的鱼头软骨汁液充分混匀后进行二次熬制，同时按照调味配方进行调味，熬制、热罐装并杀菌。

1.3.2 实验动物分组及造模

8 周龄哺乳期雌性Wistar大鼠24 只，Wistar大鼠分娩当日记为第0天，适应性喂养3 d后，每窝带有的仔鼠数量均为10 只，使用随机数表法将Wistar母鼠随机分为空白组（生理盐水）、缺乳模型组（溴隐亭）、阳性对照组（乳清蛋白鲈鱼粉）、实验组（鲟鱼头汤），每组6 只，对哺乳期Wistar母鼠进行连续14 d灌胃。

根据大鼠与正常人给药量换算系数（6.3）、大鼠胃容积（0.9 mL/100 gmb）灌胃干预，按照大鼠与人体的受药量公式换算每只大鼠的灌胃剂量。除空白组外，其余各组大鼠灌胃溴隐亭1.6 mg/kgmb，建立缺乳模型大鼠。实验组大鼠同时灌胃1.05 g/kgmb鲟鱼头汤（鲟鱼头汤低温冻干浓缩成粉状，用蒸馏水配制0.5 g/mL鲟鱼头汤冻干粉溶液）；
阳性对照组大鼠灌胃1.05 g/kgmb乳清蛋白鲈鱼粉（用蒸馏水溶解，配制0.5 g/mL乳清蛋白鲈鱼粉溶液）；
空白组大鼠灌胃相同剂量的0.9 g/100 mL生理盐水。

末次给药后母鼠禁食、不禁水12 h，母鼠腹主动脉取血，收集血清，然后脊椎脱臼法处死母鼠，取乳腺组织，进行后续实验探究。

1.3.3 乳腺相对质量测定

参考文献[16-17]的方法，每只母鼠乳腺相对质量按式（1）计算。

1.3.4 泌乳量测定

从给药日开始，每日上午10点称量全窝10 只仔鼠总体质量，记为m1/g，然后将母鼠与仔鼠分笼4 h后，再次称量整窝仔鼠体质量，记为m2/g，再将母鼠与仔鼠放在同一笼，在大鼠哺乳喂养1 h后称量整窝仔鼠体质量，记为m3/g。母鼠每小时的泌乳量为母鼠对仔鼠哺乳1 h前后整窝仔鼠体质量之差与仔鼠每小时平均基础代谢量的总和[18-19]，按式（2）计算。

1.3.5 仔鼠窝重净增率测定

仔鼠窝重净增率按式（3）计算。

式中：m14为灌胃第14天（末次给药后）整窝仔鼠体质量/g；
m0为灌胃第1天整窝仔鼠体质量/g。

1.3.6 母鼠乳腺组织病理观察

在无菌手术下取第3对左侧乳房，浸泡固定于体积分数10%甲醛溶液中。取出固定后的乳腺组织，使用常规石蜡包埋，切片，然后进行苏木精-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色，采用光学显微镜，对母鼠乳腺组织进行病理组织学观察。

1.3.7 免疫组化法检测母鼠乳腺组织PRL、β-CN表达

采用二甲苯溶液对母鼠乳腺组织石蜡切片进行脱蜡处理，梯度乙醇溶液和蒸馏水清洗。将清洗后的乳腺组织切片置于盛有柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）的修复盒中，并将其放入微波炉，中火加热4 次，每次5 min，用于修复抗原。修复后的组织切片置于体积分数3%过氧化氢溶液中室内避光孵育25 min后，蒸馏水洗涤5 min，共3 次。之后用3% BSA室温封闭30 min后，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育50 min。再向切片加入DAB显色液后水洗，苏木素复染3 min后自来水冲洗并返蓝。体积分数75%、85%乙醇溶液和无水乙醇梯度脱水（各5 min），正丁醇脱水5 min，二甲苯透明，中性树胶密封片。采用光学显微镜观察染色情况并拍照。

1.3.8 ELISA法检测PRL、PRLR、β-CN、α-LA、LS、FAS水平

末次给药后母鼠禁食、不禁水12 h，于次日上午大鼠下腹部注射质量分数10%水合氯醛溶液用于麻醉，腹主动脉取血，使用非抗凝真空采血管收集，4000 r/min离心15 min。取上清液放置于1.5 mL离心管中，于－80 ℃冰箱冻存。大鼠处死后迅速分离乳腺组织，取大小适宜的大鼠乳腺组织，加入生理盐水用研磨珠研磨，制备10%的组织匀浆液，3000 r/min离心10 min，取上清液备用。

根据ELISA试剂盒说明书步骤，分别加入PRL、PRLR、β-CN、α-LA、LS和FAS一抗，37 ℃孵育1 h，弃去孔内液体并用洗液清洗3 次。各孔加入相应的HRP标记二抗孵育30 min，然后加入TMB显色液于避光环境中继续孵育30 min，最后加入终止液，用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度。计算血清与乳腺组织中PRL、PRLR，以及乳腺组织中β-CN、α-LA、LS和FAS的含量。

1.3.9 实时荧光定量PCR检测乳腺组织中β-CN、α-LA及FAS基因表达水平

制备母鼠乳腺组织匀浆，提取RNA，然后稀释RNA提取液至适宜浓度。对稀释后RNA提取液进行反转录，每个产物配制3 管，进行PCR扩增。95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循环40 次。定义空白组各基因表达水平为1，采用2－ΔΔCt法计算基因相对表达量。基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 数据统计与分析

2.1 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠乳腺相对质量的影响

如图1所示，模型组大鼠乳腺相对质量较空白组显著降低，而阳性组和鲟鱼头汤组乳腺相对质量相对于模型组显著提高（P＜0.05），且与空白组相比无显著差异（P＞0.05），说明鲟鱼头汤组母鼠乳腺相对质量已基本恢复至正常水平。

图1 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠乳腺相对质量的影响Fig.1 Effect of sturgeon head soup on mammary gland to body mass ratio in rats with postpartum hypogalactia

2.2 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠泌乳量的影响

如图2所示，从灌胃第2天开始（除灌胃第8天），缺乳模型组母鼠的泌乳量较空白组显著降低（P＜0.05），而鲟鱼头汤组泌乳量显著高于缺乳模型组（P＜0.05），并持续至灌胃结束。整个灌胃期，空白组、阳性对照组和鲟鱼头汤组之间泌乳量总体无显著差异（P＞0.05），说明在实验灌胃14 d周期内，与空白组相比，模型组会明显抑制泌乳量的增加；
与模型组相比，阳性对照组和鲟鱼头汤组能够促进大鼠泌乳，使泌乳量与对照组接近。

图2 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠泌乳量的影响Fig.2 Effect of sturgeon head soup on milk productivity of rats with postpartum hypogalactia

2.3 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠的仔鼠窝重净增率的影响

如图3所示，缺乳模型组仔鼠窝重净增率显著低于空白组，与缺乳模型组相比，阳性对照组与鲟鱼头汤组仔鼠窝重净增率显著增加（P＜0.05），且空白组、阳性对照组及鲟鱼头汤组之间无显著差异（P＞0.05），表明在灌胃14 d后缺乳模型组仔鼠体质量增长较少，阳性对照组及鲟鱼头汤组仔鼠体质量增率能够恢复至正常水平。

图3 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠的仔鼠窝重净增率的影响Fig.3 Effect of sturgeon head soup on percent body mass gain of the whole litter of suckling rats

2.4 母鼠乳腺外观与乳腺组织HE染色观察结果

由图4可知，空白组、阳性对照组和鲟鱼头汤组母鼠腹部皮肤更为饱满充盈，剖开腹部皮层，钝性分离腹部皮肤后，可以观察到模型组的乳腺组织在胸腹部皮下分布较少，且呈现灰白色，无光泽。而鲟鱼头汤组胸腹部皮下有大量乳腺组织分布，腺体呈肉粉色，饱满有光泽，乳腺外观几乎恢复至与空白组一致。

图4 母鼠胸腹部皮下乳腺外观Fig.4 Appearance of subcutaneous mammary glands in thorax and abdomen of female mice

如图5所示，在低倍镜视野下可明显观察到，与空白组相比，缺乳模型组母鼠的乳腺脂肪结缔组织数量明显增多，呈孔洞空白状。在高倍镜视野下可以看出，缺乳模型组母鼠腺泡数量稀少且不充盈，乳腺小叶分叶不明显，乳腺呈萎缩状，腺腔内分泌物数量明显减少。而与缺乳模型组相比，阳性对照组和鲟鱼头汤组母鼠乳腺中结缔组织和脂肪组织相对分布较少，有更多新发育的腺泡，腺泡呈圆形，小叶内腺泡大量增生，在腺管中可以看到有较多分泌物，乳腺小叶有较明显的恢复。

图5 母鼠皮下乳腺组织HE染色结果Fig.5 HE staining of subcutaneous mammary gland tissues of female rats

2.5 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠乳腺组织PRL、β-CN表达的影响

如图6所示，免疫组化分析中PRL、β-CN蛋白呈棕黄色阳性显色，多见于乳腺组织的分泌小叶内以及各腺泡组织和乳腺导管细胞处。与空白组相比，缺乳模型组的棕黄色区域较少，说明其PRL、β-CN蛋白表达量明显减少；
与缺乳模型组比较，鲟鱼头汤组PRL、β-CN蛋白表达量明显增多。空白组、阳性对照组和鲟鱼头汤组PRL、β-CN蛋白表达量无明显差异。这与杨亚洁等[20]研究结果一致。

图6 母鼠乳腺中PRL、β-CN蛋白表达的免疫组化染色图Fig.6 Immunohistochemical staining of PRL and β-CN protein expression in the mammary gland of female rats

2.6 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠血清与乳腺中激素水平和相关乳蛋白表达的影响

2.6.1 血清和乳腺中PRL、PRLR水平

泌乳过程受生理、心理和激素调节的共同作用，是较为复杂的生理过程，其中PRL是泌乳过程中的一种主要激素[20-21]。PRL是一种单链多肽类激素，对哺乳动物乳腺组织的生长、发育、分化以及乳汁的生成具有调节作用，用于动物产后泌乳的启动和维持[22]。产后泌乳中乳腺受到脑垂体分泌的PRL调节，而体内PRL激素水平降低往往是导致产后缺乳的重要原因[23]。PRL随血液循环进入乳腺组织并与乳腺组织中的PRLR结合，从而发挥生物效应，共同刺激乳腺泌乳[24]。在乳腺上皮细胞以及基质细胞中均有PRLR表达，在妊娠和哺乳期过程中乳腺也在不断发育，期间PRLR的表达水平逐渐增加[25]。PRLR表达量的增加可以为PRL提供充足的结合位点，更好地促进泌乳。

本实验采用甲磺酸溴隐亭降低产后大鼠PRL激素水平，减少其乳汁分泌，以构建缺乳大鼠模型[26]。为进一步明确鲟鱼头汤改善产后缺乳大鼠泌乳的机制，测定产后大鼠乳腺与血清中PRL与PRLR水平。由图7可知，模型组大鼠乳腺与血清中PRL与PRLR水平均较空白组显著减少（P＜0.05），而阳性组和鲟鱼头组大鼠乳腺与血清中PRL与PRLR水平相对模型组显著增加（P＜0.05），且鲟鱼头汤组与阳性对照组效果相似，均与正常组无显著差异（P＞0.05）。

图7 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠乳腺与血清中PRL（A）、PRLR（B）水平的影响Fig.7 Effect of sturgeon head soup on the levels of PRL (A) and PRLR(B) in the mammary gland and serum of rats with postpartum hypogalactia

2.6.2 乳腺中乳蛋白及乳糖、乳脂合成酶含量

乳蛋白主要包括酪蛋白以及乳清蛋白等，是评价乳品质的重要依据。β-CN是酪蛋白中的一种，由乳腺腺泡上皮细胞产生[27]，其含量占乳蛋白总量的30%～35%[28-29]，且蛋白结构相对稳定。研究表明β-CN的合成与分泌可表征乳腺细胞泌乳功能[30-31]。由图8A可知，与空白组比较，缺乳模型组大鼠乳腺组织中β-CN和α-LA含量均显著降低（P＜0.05）；
与产后缺乳模型组比较，鲟鱼头汤组大鼠乳腺组织中β-CN、α-LA含量均显著增加（P＜0.05）。这说明鲟鱼头汤不仅能够提高泌乳量，也能够促进乳汁中乳蛋白的分泌，提高乳汁质量。

乳糖是一种乳汁特异性碳水化合物，在哺乳期由乳腺上皮细胞合成[32]，其含量可直接反映乳汁的质量。乳脂也是乳汁中的一个重要组分，其产生过程如下：首先，合成乳中脂肪酸，其中一部分乳脂肪酸通过乳腺血液循环摄入，然后由乳腺中的短中链脂肪酸合成[33]，还有一部分乳脂肪酸是乳腺上皮细胞在脂肪酸合成酶作用下，利用乙酸和β-羟基丁酸从头合成链长小于C16的脂肪酸及占比约50%的C16脂肪酸[34]；
然后，合成甘油三酯，从头合成或外源摄取的脂肪酸在乳腺上皮细胞内质网上通过相关调控酶合成甘油三酯主链；
最后，在乳腺细胞内质网中甘油三酯等中性脂质合成脂滴，随着脂滴的汇聚并移动到顶膜，经乳腺上皮细胞以乳脂肪球的形式分泌到乳中[35]。因此，LS、FAS对乳汁的营养至关重要。

由图8B可知，相比空白组，模型组乳腺组织中LS、FAS含量均显著降低（P＜0.05），而鲟鱼头汤组LS、FAS含量相对模型组显著升高，并与空白组无显著差异（P＞0.05）。

图8 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠乳腺中β-CN、α-LA、LS与FAS含量的影响Fig.8 Effect of sturgeon head soup on the contents of β-CN,α-LA,LS and FAS in the mammary gland of rats with postpartum hypogalactia

2.7 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠乳腺中乳蛋白和乳脂相关基因表达的影响

乳腺是蛋白质、脂肪等物质合成的重要场所，其通过一系列生物化学过程合成并分泌乳汁[36]。乳汁中包含许多的营养成分，乳腺上皮细胞从血液中吸收营养物质并将其转化为乳蛋白、乳脂等并分泌到腺泡中[37]。通过检测乳腺组织中的相关乳蛋白、乳脂基因的表达水平，验证分泌乳汁的质量。如图9所示，与模型组相比，鲟鱼头汤组中控制乳蛋白合成基因β-CN、α-LA以及乳脂合成相关基因FAS表达水平显著上调（P＜0.05），且显著高于空白组和阳性对照组；
阳性对照组虽也有所上调，但显著低于鲟鱼头汤组（P＜0.05）。说明鲟鱼头汤促进缺乳大鼠泌乳的功效机制可能与其促进乳腺组织中β-CN、α-LA及FAS基因表达有关。

图9 鲟鱼头汤对产后缺乳大鼠乳腺中β-CN（A）、α-LA（B）与FAS（C）mRNA表达量的影响Fig.9 Effect of sturgeon head soup on the mRNA expression of β-CN (A), α-LA (B) and FAS (C) in the mammary gland of rats with postpartum hypogalactia

鲟鱼头汤具有显著增加产后缺乳大鼠泌乳量的作用，实验结果证实鲟鱼头汤具有促进泌乳的功效；
推测其可能作用机理是鲟鱼头汤提高了大鼠血清中PRL水平，促进乳腺组织中PRL和β-CN蛋白表达，还可提高乳腺组织β-CN、α-LA以及FAS基因表达，可能与鲟鱼头中含有催乳素[12]有关。本研究表明鲟鱼头汤具有良好的治疗缺乳功效，为食疗催乳的研究提供了参考。此外，鲟鱼头汤可作为一种功能性食品，其不含药物成分，具有较高的安全性，降低了产妇因服用药物催乳导致的不良反应，并减少了传统中药汤剂熬制过程繁琐与味苦难以下咽的缺陷。未来可进一步探究鲟鱼头汤促进泌乳的作用是否与鲟鱼头部（脑垂体）的催乳素相关，及其进入体内具体作用靶点和相关调控分子机制。

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