产漆酶食用菌的筛选及食用菌漆酶降解黄曲霉毒素B1的研究进展

娄海伟，杨创明，赵 玉，牛永武，田双起,*，赵仁勇,*

（1.河南工业大学 小麦和玉米深加工国家工程研究中心，河南 郑州 450001；
2.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是一类主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）产生的次级代谢产物[1]。目前已发现的AF有20余种，该类化合物均具有一个二呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），常见的AF有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等，其毒性由强到弱依次为AFB1、AFM1、AFG1、AFB2、AFM2、AFG2[2]。由于AFB1的毒性强、污染性广、致癌性强，已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为IA类致癌物[3]，AFB1污染食品会对人类和牲畜健康造成极大的危害[4]。因此，各个国家和组织对食品和饲料中AFB1含量有明确的限量要求，如我国GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》和GB 13078-2017《饲料卫生标准》分别对食品和饲料原料、饲料产品中AFB1含量有明确的限量要求。不可控的自然环境因素（如高温、降雨等）以及谷物收获后不适宜的贮藏或加工条件都会引起谷物中霉菌大量繁殖并产生真菌毒素，最终导致谷物中AFB1含量超出限量标准，谷物食用价值降低或丧失，造成重大经济损失，因此研究人员一直致力于研究减少或消除谷物中的AFB1的方法。目前，消减谷物中AFB1的方法主要有如下3 类[5]：1）物理法，包括高温、辐照等方法，对AFB1消减有一定效果，但会导致谷物营养成分的损失；
2）化学法，包括碱处理、氧化剂处理等，对AFB1的脱毒效果好，但会造成二次污染；
3）生物法，该方法是利用微生物或酶制剂降解AFB1，是近年来的研究热点，该方法对底物AFB1的专一性强、反应条件温和、降解效果稳定且效率高，极具发展潜力[6]。漆酶（EC 1.10.3.2）[7-9]、锰过氧化物酶[10-11]、葡萄糖氧化酶[12]等均可以降解AFB1，其中漆酶是一种无污染的绿色环保型催化剂[13]，因此利用漆酶降解AFB1引起了研究人员的广泛关注。

漆酶是一种广泛存在于植物（如漆树、棉花、马铃薯等）、真菌（如云芝、平菇、杏鲍菇等）、细菌（如芽孢杆菌、假单胞杆菌等）和昆虫中的酚类氧化酶[14]，在食品工业、纤维改性、生物合成、环境保护、印染、造纸、生物传感器、生物能源、免疫监测、饲料等领域已有广泛的应用[13,15]。相对于植物漆酶和细菌漆酶，真菌漆酶的相关研究报道较多[16-17]，而食用菌是真菌漆酶的主要来源之一[18]。无毒无害且可食用的产漆酶食用菌可作为食品或饲料领域降解AFB1的重要微生物。基于此，本文从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）和Uniprot数据库（Unified Protein Database，www.uniprot.org）中筛选具有漆酶基因序列或氨基酸序列的食用菌，总结已报道的产漆酶食用菌，并介绍食用菌漆酶的结构、理化性质及其对AFB1的降解作用，以期为食用菌漆酶安全、高效、绿色降解AFB1提供参考。

1.1 基于生物信息学数据库和文献报道筛选产漆酶的食用菌

食用菌种类繁多，且不同菌种之间性状差异很大，筛选产漆酶的菌种是一项任务非常繁重的工作。因此，基于生物信息学数据库NCBI和Uniprot，能够快速筛选到具有漆酶基因序列或氨基酸序列的食用菌，基于NCBI数据库检索具有漆酶基因序列食用菌的路径为NCBI数据库→选择Nucleotide→输入laccase并点击Search→选择“真核生物（eukaryotes）”条目下的“真菌（fungi）”，可获得13858 条目（items）；
基于Uniprot数据库检索具有漆酶氨基酸序列食用菌的路径为Uniprot数据库→选择UniProtKB→输入laccase并点击Search→获得16885 条目，然后从上述获得的条目中筛选出食用菌（表1）。此外，本文亦对已报道的产漆酶食用菌进行总结（表1）。从NCBI数据库筛选出97 种具有漆酶基因序列的食用菌，从Uniprot数据库筛选出93 种具有漆酶氨基酸序列的食用菌，已报道的能够产漆酶食用菌有75 种，合计筛选出食用菌133 种，这有利于学者们缩小食用菌的筛选范围或快速、简便地锁定产漆酶食用菌。

表1 产漆酶的食用菌和具有漆酶基因序列（或氨基酸序列）的食用菌Table 1 Edible fungi with the ability to secrete laccase and those with laccase gene sequences (or amino acid sequences)

续表1

1.2 产漆酶食用菌的实验筛选方法

从众多的食用菌中筛选出产漆酶食用菌是一项繁重而复杂的工作，因此，学者们建立了产漆酶食用菌的实验筛选方法（初筛和复筛）。即使对于表1中的食用菌，也需要采用如下方法进行验证。

1.2.1 初筛方法

产漆酶食用菌的初筛方法为平板显色法。根据培养基中添加底物的不同，平板显色法划分类型如表2所示。除了表2中的几种初筛方法外，也有学者向培养基中添加联苯胺、2,6-二甲氧基苯酚等试剂进行平板显色初筛[23,100]，但是相比而言，学者们认为愈创木酚平板显色法产生的氧化带颜色较明显、显色较早、结果较可靠且相关研究报道较多[101]。

表2 检测食用菌是否产漆酶的平板显色法Table 2 Features of chromogenic plate methods for detecting for the secretion of laccase from edible fungi

以上方法常依据变色速率、颜色、变色圈直径、变色圈和菌丝圈直径的比值来判断食用菌是否产漆酶和产漆酶的能力。笔者课题组研究（结果尚未发表）表明，采用平板显色法判断食用菌是否产漆酶的准确性较高，而通过颜色深浅、比值（变色圈和菌丝圈直径的比值）判断食用菌所产漆酶的活力大小有时会存在较大差异，因此，笔者认为平板显色法适用于判断食用菌是否产漆酶，不适用于对食用菌所产漆酶的活力进行定量分析。

1.2.2 复筛方法

由于初筛不能确定菌株所产漆酶的活力，因此，需要采用复筛来进一步确定菌株是否产漆酶及所产漆酶的活力。基于食用菌漆酶是胞外酶，在复筛时常将食用菌进行液体深层发酵，然后离心获得含有漆酶的上清液，对含有漆酶的上清液进行酶活力测定[102]。测定漆酶活力的方法有高效液相色谱法、微量热法、测O2法、分光光度计法、脉冲激光光声法等。其中分光光度计法具有操作简便、设备成本低、测定快速、准确等优点，其应用广泛，相关研究报道也最多。根据底物的不同，分光光度计法又分为愈创木酚法[103]、ABTS法[23]、丁香醛连氮法[104]等，其中ABTS法、愈创木酚法测定漆酶活力的稳定性和重现性较好，较为常用，如Xu Jianzhong等[33]采用ABTS法测定大杯伞漆酶的活力（701 U/L），Umar等[41]采用愈创木酚法测定白肉灵芝漆酶的活力（6540 U/L）。

2.1 食用菌漆酶的结构

漆酶是一类含铜离子的多酚氧化酶，食用菌漆酶一般为高度糖基化的胞外分泌的蛋白[105]，其稳定性很大程度上是由糖基化贡献的[106]，通常含有4 个铜离子（I型铜离子1 个、II型铜离子1 个、III型铜离子2 个），4 个铜离子分布在漆酶的3 个氧化还原活性中心。T1活性中心（即I型铜离子（单电子受体）所在位点）是漆酶与底物的结合位点，该位点的氧化还原电势直接影响漆酶的氧化能力[107]。食用菌漆酶在催化底物时，其T1活性中心首先与底物结合，然后I型铜离子（Cu2＋）夺取底物电子并转变为Cu＋，电子再经由His-Cys-His三肽区域传递给II型铜离子和III型铜离子中心，在此催化过程中，底物被氧化降解，O2被转化为H2O，无其他副产物产生[108]，因此，漆酶被称为绿色催化剂[13]。

2.2 食用菌漆酶的理化性质

不同来源漆酶的理化性质存在一定的差异，漆酶的理化性质主要由其蛋白编码基因决定。不同食用菌漆酶的氨基酸序列（或核苷酸序列）并不相同，而且食用菌基因组中通常存在多条漆酶编码基因，如平菇有12 条漆酶编码基因[109]、香菇有14 条漆酶编码基因[110]、真姬菇有10 条漆酶编码基因[111]、黑木耳有7 条漆酶编码基因[29]、草菇有11 条漆酶编码基因[112]，这些差别使食用菌漆酶具有不同的理化性质。

2.2.1 pH值

不同食用菌漆酶常具有不同的最适pH值，但通常最适pH值偏酸性，如松杉灵芝漆酶（分子质量52 kDa）的最适pH值为4，在此pH值条件下，松杉灵芝漆酶具有良好的稳定性，当pH值降低或升高时，其稳定性逐渐下降[113]；
巴尔喀什蘑菇漆酶的最适pH值为2.2，在pH值为7～9时，其活力基本丧失[19]；
一种中国美味蘑菇漆酶的最适pH值为5.0[23]。综上，食用菌漆酶的最适pH值通常在2～6之间，偏离此pH值范围，漆酶活力会显著降低。如果欲在碱性条件下使用食用菌漆酶，可考虑采用基因工程技术改变漆酶的最适pH值或pH值适用范围，如采用定点突变技术改变漆酶的氨基酸序列，筛选获得在碱性条件下具有良好漆酶活力的基因工程改造酶，然后通过异源表达获得大量改造后的漆酶，以满足应用需求。

2.2.2 温度

食用菌漆酶的最适温度一般不超过60 ℃，这主要与其结构和来源有关，如花脸香蘑漆酶有3 个保守结构域（Cu-oxidase I、Cu-oxidase II和Cu-oxidase III），其最适温度为60 ℃，当温度低于60 ℃时，其活力随着温度的升高而逐渐增大，当温度高于60 ℃时，其活力随着温度的升高而急剧减小[55]；
巴尔喀什蘑菇漆酶不耐高温，最适温度为40 ℃，在4～50 ℃之间相对稳定，当温度高于50 ℃时，其酶活力急剧下降[19]。来自同一食用菌的不同基因编码漆酶，其最适温度也存在不一样的情况，如白灵侧耳的漆酶Lac1（分子质量68 kDa）和Lac3（分子质量51 kDa）的最适温度为50～60 ℃，漆酶Lac2（分子质量64 kDa）的最适温度为60 ℃，在热稳定性方面，漆酶Lac2较Lac1和Lac3更稳定[114]。食用菌漆酶的不耐高温特性使其应用范围受到一定的限制，如果需要耐高温的漆酶，可采用基因工程技术（如定点突变和异源表达）改造漆酶的氨基酸序列以构建耐高温漆酶。

2.2.3 金属离子

金属离子对食用菌漆酶的活性有显著的影响，对漆酶活力起促进作用还是抑制作用，这与金属离子的种类和浓度有关，如Fe3＋对平菇漆酶的活力起抑制作用，随着Fe3＋浓度的增加，对漆酶活力的抑制作用增强，而Cu2＋对平菇漆酶活力的影响主要与其浓度有关，当Cu2＋浓度为1 mmol/L时，对漆酶的活力起促进作用，当Cu2＋浓度为5 mmol/L时，漆酶的活力受到抑制[115]；
Na＋、K＋、Mg2＋对花脸香蘑漆酶的活力无显著影响，Zn2＋、Al3＋抑制花脸香蘑漆酶的活力且随离子浓度的增加抑制作用显著增强，Mn2＋在低浓度时促进花脸香蘑漆酶活力，在高浓度时抑制漆酶活力[55]；
Hg2＋显著抑制口蘑漆酶的活力[89]，Hg2＋和Cd2＋亦显著抑制中国美味蘑菇漆酶的活力[23]。因此，在使用食用菌漆酶时要严格控制或调整金属离子的种类和浓度，使漆酶的活力得到充分发挥。

3.1 食用菌漆酶的作用

漆酶在食用菌生长过程中主要起到如下5 个方面作用：1）参与食用菌色素的形成[13]；
2）降解木质素，为食用菌生长发育提供营养[116]；
3）参与食用菌的呼吸作用并承担传递电子的作用，促进食用菌的生长发育[117]；
4）催化木质素降解产生酚类或醌类物质，酚类和醌类物质的毒性能够抑制杂菌的生长[118]；
5）调控食用菌原基的分化，改善食用菌产量和品质[119-120]。

3.2 漆酶的底物

漆酶的作用底物十分广泛，主要包括：1）酚类及其衍生物[108]；
2）芳胺类及其衍生物（芳胺类化合物与酚类化合物的结构相似）[121]；
3）羟酸及其衍生物[122]；
4）生物色素和甾体激素[123-124]；
5）金属有机化合物[125]；
6）一些非酚类化合物[126]。漆酶催化底物氧化需要满足2 个条件，首先底物能够进入漆酶的活性中心并与漆酶结合；
其次底物和漆酶之间要存在氧化还原电势差。如果底物的氧化还原电势较高或无法进入漆酶的活性中心，导致底物不能被漆酶直接氧化，此时可借助小分子介体实现底物和漆酶之间电子的传递，以间接实现底物的氧化，这就是漆酶的介体体系，此体系可扩大漆酶催化的底物范围[6,127]。

3.3 食用菌漆酶对AFB1的降解

食用菌是一类可以食用或药用的大型真菌[128]，其产生的漆酶也是安全的，因此，采用食用菌或食用菌漆酶来降解谷物中的AFB1是一种安全、高效且极具发展潜力的方法，如果采用食用菌发酵已污染AFB1的谷物，不仅能够降解AFB1，同时还能丰富谷物的营养成分。目前，已报道的能够降解AFB1的产漆酶食用菌主要有如下几种。

3.3.1 平菇漆酶

有关平菇产漆酶的研究报道较多，然而有关平菇漆酶降解AFB1的报道较少。Alberts等[129]研究了不同液体培养基（葡萄糖-麦芽提取物-酵母提取物培养基、基础盐培养基、矿物盐-麦芽提取物培养基、小麦秸秆培养基）对平菇产漆酶的影响，发现平菇在基础盐培养基中所产的漆酶活力最高（416.39 U/L），此培养基滤液（含漆酶）对AFB1的降解率可达35.90%。平菇不仅能够降解谷物中的AFB1，还能降解农业副产物中的AFB1，如采用平菇发酵已污染AFB1的水稻秸秆，平菇菌株MTCC142和菌株GHBBF10对AFB1的降解率分别可达89.14%和91.76%，而且加入Cu2＋和Zn2＋可有效提高AFB1的降解率；
因此，采用平菇发酵动物饲料是一个生态环境友好的降解AFB1的方法[130]。平菇的漆酶活力越高，则降解AFB1的能力越强，即平菇的漆酶活力与其AFB1降解率呈正相关[131]。

3.3.2 云芝漆酶

云芝漆酶能够直接氧化AFB1，且AFB1降解产物的致突变性、促氧化能力和肝毒性显著降低[8,132]。何杜鹃等[133]采用双水相法萃取云芝漆酶，并将萃取的云芝漆酶（80 U/mL）用于降解AFB1，使AFB1的降解率达到了46.32%。Alberts等[129]采用Sigma公司生产的云芝漆酶（1 U/mL）降解AFB1，AFB1的降解率达到了87.34%，远远高于何杜鹃等研究中的结果，这可能是酶解条件（酶解温度、酶解时间和AFB1的浓度）不同所致，Alberts等[129]认为漆酶能够破坏AFB1分子中呋喃环的双键，从而影响其荧光和致突变性。Liu Yingli等[134]研究发现漆酶与AF的结合能力由强到弱依次为AFB1＞AFG2＞AFG1＞AFB2，结合能力越强，则漆酶降解AF的效率越高，同时，其将云芝漆酶基因在酿酒酵母中进行异源表达，然后采用重组的云芝漆酶分别降解AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，降解率分别可达90.33%、74.23%、85.24%和87.58%，最适降解条件为30 ℃、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液、pH 5.7、降解时间48 h。

3.3.3 杏鲍菇漆酶

有关杏鲍菇漆酶降解AFB1的研究报道较少，但杏鲍菇漆酶能够有效降解AFB1。Brana等[135]从杏鲍菇菌糠中提取漆酶并获得了漆酶粗提物，在25 ℃条件下，采用漆酶粗提物降解AFB1，分别孵育1、3、7 d，使AFB1的降解率分别达到了50%、75%和90%。介体不仅可提高漆酶对AFB1的降解效率，还可使漆酶同时降解多种真菌毒素，如Loi等[6]采用酿酒酵母表达杏鲍菇漆酶，经纯化获得了重组漆酶，然后采用纯化的重组漆酶分别降解AFB1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和T-2，在25 ℃条件下降解72 h，上述毒素的降解率分别达到了73%、74%、27%、100%和40%，采用重组漆酶和氧化还原介体可同时降解AFB1和玉米赤霉烯酮，使AFB1和玉米赤霉烯酮的降解率分别达到了86%和100%。杏鲍菇在液体培养基和固体培养基中均可降解AFB1，在含有128 μg/kg AFB1和质量分数25%玉米的生长培养基上栽培杏鲍菇，28 d时AFB1降解率为86%，而且杏鲍菇的生物效率和产量无显著降低，在杏鲍菇菌丝体和子实体中均未检测到AFB1及其降解产物，表明培养基中的AFB1并不向杏鲍菇中转移[136]。

此外，肺形侧耳漆酶亦能够直接氧化AFB1，其对AFB1的直接氧化降解率为23%，添加乙酰丁香酮介体后，AFB1的降解率提高至90%，肺形侧耳漆酶不仅能够降解AFB1，而且还能够完全降解AFM1[137]。除了上述几种食用菌，其他产漆酶食用菌降解AFB1的研究鲜有报道。

由于自然环境因素，每年存在大量的谷物被AFB1污染，不但造成重大经济损失，而且严重危害人体健康和生态环境，因此，高效降解AFB1已成为亟待解决的问题。目前，降解AFB1的方法有物理法、化学法和生物法，生物法因具有底物特异性强、降解条件温和等优点，受到学者的广泛关注。在降解谷物中AFB1时应采用食用安全的微生物，因此，具有食用安全、营养丰富等特点的食用菌可用于降解谷物中的AFB1。前人的研究结果表明，食用菌漆酶能够高效降解AFB1。基于此，本文首先从生物信息学数据库（NCBI和Uniprot）中筛选具有漆酶基因序列或氨基酸序列的食用菌，对已报道的能够产漆酶的食用菌进行了总结，并简述了产漆酶食用菌的实验筛选方法；
其次，探讨了食用菌漆酶的结构和理化性质；
最后，阐述了食用菌漆酶的作用、漆酶的作用底物及食用菌漆酶对AFB1降解作用的研究进展，可为食用菌漆酶绿色、安全、高效降解AFB1提供参考，亦可为扩大食用菌漆酶在食品或饲料领域的应用提供思路。

采用食用菌漆酶降解AFB1极具发展潜力，但是目前仍然存在如下几个亟待解决的问题：1）筛选高产漆酶的食用菌菌株；
2）采用基因工程技术构建耐高温、耐酸或耐碱、酶活力高的工程漆酶以满足不同领域的需求；
3）鉴定AFB1降解产物的结构和分析降解产物的性质，以揭示漆酶对AFB1的降解机理；
4）开发食用安全、无环境污染的介体以扩大漆酶作用的底物范围或提高漆酶的催化效率；
5）谷物中存在同时污染多种真菌毒素的情况，需开发可同时高效降解多种真菌毒素的食用菌漆酶。

猜你喜欢 漆酶平菇谷物 临清市平菇绿色高产栽培技术农业知识(2022年9期)2022-10-13五寨燕麦晋粒康“边煮边发芽”的神奇谷物今日农业(2022年13期)2022-09-15乌克兰谷物和油料作物库存远低于2020年同期今日农业(2021年17期)2021-11-26乌克兰谷物和油料作物库存远低于2020年同期今日农业(2021年9期)2021-07-28击打式谷物加工农具军事文摘(2020年20期)2020-11-16平菇种植记小学生(看图说画)(2020年10期)2020-10-29平菇菌糠在动物生产中的应用湖南饲料(2019年4期)2019-10-17以竹粉为基质固态培养虫拟蜡菌及其产漆酶条件研究安徽农学通报(2017年8期)2017-05-12青霉菌产漆酶的研究及在木质素降解中的应用湖北农业科学(2014年10期)2014-09-22香灰菌传代对银耳栽培的影响江苏农业科学(2014年4期)2014-07-11

推荐访问:食用菌 黄曲霉 降解