酶促生物电催化系统的设计构建与强化

崔馨予，吴冉冉，王园明，朱之光，3

（1中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；
2中国科学院大学，北京 100049；
3国家合成生物技术创新中心，天津 300308）

酶促生物电催化（enzymatic bioelectrocatalysis）是指以氧化还原酶为生物催化剂，在电极上发生的催化反应［1-2］。在酶的催化作用下，阳极将底物氧化，产生电子；
阴极则可利用电子将底物还原，生成产物（图1）。根据电子传递方式不同，分为直接电子传递（direct electron transfer，DET）和间接电子传递（mediated electron transfer，MET）。酶促生物电催化结合了生物催化剂高活性、高选择性、温和反应条件，以及电催化可利用可再生电能作为电子源和高能量转换效率的优势，已广泛应用于生物传感器和生物燃料电池的构建。此外，酶促生物电催化在合成化学品、生物燃料和材料等方面也开辟了新的研究方向。与传统生物催化相比，酶促生物电催化利用电极作为电子供体或受体与氧化还原酶的催化反应相耦合［3］，无需额外添加其他酶或共底物，还可通过改变电极电势调节催化反应的速度和方向，具有更高的系统灵活性和便捷性。

图1 酶促生物电催化系统示意图Fig.1 Schematic of an enzymatic bioelectrocatalytic system

Nature Catalysis杂志2020年3月刊关于人工生物催化系统特刊中的8篇综述有3篇与生物（光）电催化相关，可见越来越多研究开始关注利用电化学、材料科学等交叉技术拓展生物催化范畴，并聚焦于可持续发展［4-6］。目前酶促生物电催化的主要应用领域包括酶燃料电池（enzymatic fuel cell，EFC）、酶生物传感器（enzymatic biosensor）和酶电合成（enzymatic electrosynthesis，EES）［3，7-8］。其中，酶燃料电池利用氧化还原酶的催化作用将底物的化学能转化为电能，未来有望为便携式、穿戴式和植入式电子器件供电［9］。酶电合成利用电能驱动相应酶元件合成目标产物，可实现废弃、冗余电能的高效存储和转化，以及为高能化学品合成提供额外的清洁能量［10］。酶生物传感器则通过酶和目标分析物发生反应产生的电子作为可检测信号，以获得有关目标分析物类型和浓度的相关信息，在健康、环境、食品等监测领域都有应用潜力［10］。

酶促生物电催化的特征是在电极界面上发生氧化还原反应。因此，酶的催化行为，以及酶分子内部、酶与酶之间、酶与电极之间的电子传递是影响酶促生物电催化系统性能的关键因素。本文基于合成生物学的原理和方法，重点介绍了常用的氧化还原酶元件及其设计改造策略、多酶模块组装与途径构建、固定化酶电极构建、界面电子传递强化以及相关的应用系统。在总结最新研究成果的基础上，希望为未来新型生物电催化剂的开发、生物电子传递机制的研究以及酶促生物电催化产品的拓展提供有益思路。

1.1 氧化还原酶简介

根据辅因子的不同，氧化还原酶分为两类：一类是以血红素（heme）、铁-硫簇（Fe-S）、钼、铜等为活性中心的金属酶；
另一类是含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、黄 素 单 核 苷 酸（flavin mononucleotide，FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）、吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）等 的 非 金 属酶［11-16］。血红素酶的氧化还原中心由含4个亚甲基桥的吡咯环组成的卟啉环以及与中心配位的Fe（Ⅱ）或Fe（Ⅲ）组成［11］。血红素b作为最常见的血红素广泛存在于肌红蛋白、血红蛋白和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），分别具有运输氧、储存氧和催化过氧化物分解的功能。Fe-S簇氧化还原酶是借助组氨酸或半胱氨酸残基的含硫配体与铁离子配位结合的酶，例如铁氧还蛋白、氢酶和固氮酶［17-18］。铁氧还蛋白以电子载体的形式在电子供体和受体蛋白之间传递电子，如假单胞氧还蛋白［12］。氢酶中Fe-S簇的主要功能是通过氢氧化保护代谢过程。对于含NiFe和Fe的氢酶，经Fe-S簇底物通道将H+/H2从活性位点运送到蛋白质表面，与底物进行电子交换［19］。固氮酶通过其催化蛋白（MoFe、VFe和FeFe蛋白）与ATP水解电子转移铁蛋白（Fe蛋白）的金属蛋白复合物解离、ATP水解以及无机磷酸盐（Pi）形成来实现从N2到氨的合成［20-21］。含铜蛋白主要是利用电子和氧的转移来催化氧化反应，通常与氧化有机/无机自由基有关，它们几乎只在O2或NOx化合物的代谢过程中起作用，例如漆酶［22］。多铜活性位点的氧化还原电位与蛋白质底物的特异性及其氧化酚底物的能力密切相关，这是由伴随分子氧还原的热力学驱动决定的［13］。黄素酶是以FAD或FMN为辅酶的一组氧化还原酶，包括很多重要的脱氢酶。当一个电子从还原的黄素转移到氧时，会形成超氧化物和黄素自由基组成的复合物，能够催化多种氧化反应，包括羟基化、环氧化和Baeyer-Villiger氧化反应，具有很高的区域选择性和对映选择性［23］。PQQ依赖型氧化还原酶通过辅因子Ca2+与脱辅基酶进行配位后，电子通过PQQ从底物转移到血红素基团，最后转移到电子受体［15］。与NAD［−320 mV，相对于标准氢电极（standard hydrogen electrode，SHE）］或FAD（−450 mV）相比，PQQ能够在更高的氧化还原电位（+90 mV）下被两个电子还原［15］，且PQQ氧化态的C5羰基对醇、氨、胺、氰化物和氨基酸等亲核试剂反应强烈［24］。此外，一些PQQ依赖型酶可以将电子直接转移到电极表面或导电聚合物［25］。

1.2 改造方法与策略

在过去的几十年中，氧化还原酶的蛋白质工程改造在酶促生物电催化领域取得了显著进展。采用理性设计、定向进化和组合策略可成功改善酶学性质，包括热稳定性、最适pH、活性/稳定性、对盐的耐受性以及辅酶偏好性等，从而增强电催化性能［26-28］（表1）。

表1 酶元件设计策略及典型示例Tab.1 Design strategies for oxidoreductases as well as typical examples

1.2.1 定向进化

定向进化是一种模拟自然选择对酶进行改造的有效方法［52］，包括两个关键步骤：构建含有足够多突变体的文库，以及对文库建立筛选方法［53］。通过定向进化，研究人员增强了葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）的氧化活性并降低了其对氧气的敏感性，使之更加适用于酶燃料电池和生物传感器［29，54］。Zhang等［30］建立了一套基于氧化还原电势的高通量筛选方法，利用多通道恒电位仪搭载多电极阵列对96孔板中表达的漆酶（copper efflux oxidase，CueO）进行评估，从饱和突变文库筛选出的D439T/L502K突变体显著降低了阴极氧还原的过电位并将电池输出功率提高了1.72倍［图2（a）］。酶促生物电催化系统中降低阳极pH是构建高性能酶燃料电池的有效策略，但低pH对一般酶的活性和稳定性影响较大，不利于电池的长期运行。Ma等［31］利用定向进化筛选出了耐酸的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH）和 黄递酶（diaphorase，DI），其pH 5.4下的催化效率与野生型相比分别提高了42倍和4倍，且稳定性也有所改善［图2（b）］。

1.2.2 理性设计

理性设计需基于蛋白质结构及催化机理的详细信息，针对蛋白质的活性位点或结构域，利用计算机辅助设计并且借助各种生物信息学的工具和算法预测不同位点突变后对酶活力、底物特异性以及蛋白质稳定性等方面的影响，以改进氧化还原酶的结构和催化活性，使其更适用于酶促生物电催化系统［56］。例 如，将 甲 胺 脱 氢 酶（methylamine dehydrogenase，MADH）位于底物通道具有较大空间位阻的Phe55残基替换为更小位阻的丙氨酸后，对组胺的Km比野生型为原来的1/400，其构建的组胺生物传感器检测限比野生型降低了400%［33］。Wegerich等［34］在人细胞色素c血红素基团附近引入带正电荷的赖氨酸，获得的E66K突变体与超氧化物的反应速率常数提高了1倍并显示出良好的稳定性，使超氧化物传感器灵敏度提高了约40%。Hiraka等［35］通过计算分析L-乳酸氧化酶（lactate oxidase，LOx）中氧气传递途径，证明A96L突变体能够有效阻断氧通路，极大减少氧气对传感器的干扰，将L-乳酸浓度响应电流的线性范围扩大了10倍。除了改善催化性能，定点突变也可用于改变辅酶或电子中介体的偏好性或底物特异性，提高酶应用于生物电催化系统的稳定性。研究表明，将6PGDH与辅酶结合的相关位点突变为指定氨基酸（N32E/R33I/T34I）后，辅酶特异性从NADP转变为NAD，相应电池电流密度比野生型提高约25%［图2（c）］［32］。另一研究发现对葡萄糖脱氢酶（FAD glucose dehydrogenase，FADGDH）同源建模设计的S326Q/S365Y双突变体，其对葡萄糖的特异性提高了30倍，使得相应生物传感器不再受真实样品中麦芽糖的干扰［36］。

1.2.3 非天然氨基酸的引入

天然酶元件利用氧化还原活性氨基酸残基（Tyr、Trp、Met、Cys等）与辅因子作为氧化还原中心，相对于标准氢电极，氧化还原电位在−700～+800 mV，覆盖1.5 V的范围［图2（d）］［55，57］。近年来，遗传密码的扩展使得一些具有新官能团和化学性质的非天然氨基酸（unnatural amino acids，UAA）能够被引入酶的特定位点，以改善酶的氧化还原电势，优化电子转移速率和人工酶的活性，可作为改造氧化还原酶的一种新策略［58-60］。例如，将肌红蛋白（myoglobin，Mb）中的Tyr-Cys替换为非天然氨基酸后，突变酶以800 min−1的速率还原羟胺，比野生型提高3倍［37］。此外，非天然氧化还原辅因子也可以替换结构相似的天然辅因子，构建高活性和选择性的人工金属酶。Hartwig等［38，61］将含有铱等贵金属的金属卟啉作为非天然氧化还原辅因子引入肌红蛋白和P450中可进行有效的卡宾转移反应；
将3-甲氧基酪氨酸OmeY整合到抹香鲸肌红蛋白功能性氧化酶中，氧化还原电位比Tyr降低179 mV，进一步揭示了调整Tyr的还原电位在氧化酶反应中的积极作用［39］。

图2 氧化还原酶的改造方法与策略Fig.2 Methods and strategies of engineering oxidoreductases

2.1 多酶复合体模块

与单酶催化相比，多酶介导的级联反应通过模拟生物体内的多酶协同高效催化，可应用于单酶不能有效催化的反应中，成为合成生物学的研究热点［62］。然而，基于多酶反应的生物电催化系统由于其复杂性，也面临很大的挑战，包括每种酶的最佳操作条件不同，限速酶影响系统性能，以及难以回收所有酶。共固定化多酶可通过减少聚集、防止亚基分离、酶自溶或水解以及创造有利的微环境来提高稳定性［63］。有效的共固定化应模拟细胞内的多酶复合体，使多种酶在空间上相互靠近，使底物或中间物从一个酶的活性中心有效地转移到另一个酶的活性中心，不仅可缩短转运和反应时间，还能减少扩散引起的中间物损失，同时产生更少的副产品和污染物。最近，多酶复合体在酶促生物电催化中被广泛应用［64-67］，可提升系统的能量转化效率、提高反应特异性、扩展检测范围［68-71］。

多酶复合体模块可以通过以下几种方式来组装：

（1）交 联 酶 复 合 物（cross-linked enzyme aggregates，CLEA）涉及蛋白质分子之间共价键的形成，是一种通过用化学试剂来激活或耦联电极表面和多酶模块的新颖且通用的策略［72-73］。通过使用交联的己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）的双酶复合物氧化葡萄糖，可提高功率密度［74］。此外，代谢途径的顺序酶之间的相互作用会诱导底物通道的形成并提高催化效率［75］。例如，通过利用Krebs cycle代谢区室里共价连接的多酶取代非复合体酶制备的生物电催化剂，丙酮酸/空气酶燃料电池的电流密度可以提高49%［图3（a）］［76］。

（2）蛋白支架是根据蛋白相互作用，以支架蛋白为结构核心将多种酶元件对接而成的多酶自组装体［78］。例如，Meng等［79］构建的纤维糊精磷酸化酶与磷酸葡萄糖变位酶双酶复合物，通过下游酶拉动上游酶克服热力学瓶颈，将电流密度提高了3倍。Fan等［77］将葡糖淀粉酶和GOx通过与cohesin-dockerin相互作用共展示到酵母细胞表面构建的酶级联反应，显著提高了酶燃料电池的最大功率密度［图3（b）］。但由于每种酶都需要使用不同的载体进行展示，且氧化还原酶空间种类受限，导致酶拷贝数较低，影响酶级联反应的有序组装［80］。

图3 多酶复合体模块组装策略Fig.3 Strategies of multienzyme complex assembly

（3）核苷酸支架是利用DNA或RNA分子为支架结构与酶的特异性结合功能，将多酶元件聚集到支架结构形成的高效有序酶组装系统。使用交联寡脱氧核苷酸作为支架，将GOx-抗生物素蛋白和HRP-抗荧光素Fab蛋白分别组装在金电极上，可用于葡萄糖传感，且电流信号与在电极表面核苷酸支架上的酶结合位点密切相关［71］。然而单链DNA支架由于缺乏刚性可能导致空间结构的错误折叠，可考虑在二维核酸“折纸”支架上进行可控共组装［81］。

2.2 多酶催化途径的构建

基于多酶催化的生物电催化系统凭借高活性和高选择性，可用于多步转化过程和具有复杂结构的目标产物合成。与用于物质转化的多酶催化途径相似，用于生物电催化的多酶途径主要科学问题也在于其组成的各元件和模块之间的适配性。由于还涉及电子传递和不同形式的能量转化，以及电极等非生物元件的参与，该系统变得更加复杂。例如，Minteer课题组［50］开发了一种生物电催化N2固定的多酶系统，N2首先由固氮酶（MoFe nitrogenase）以甲基紫精作为电子中介体催化生成NH3，再通过由黄递酶、L-丙氨酸脱氢酶和ω-转氨酶组成的多酶级联反应，实现了电驱动固氮合成手性胺，最高法拉第效率达到27.6%［图4（a）］。其中，通过条件优化实现对氧气极度敏感的固氮酶和其他电催化元件之间的协同是一个难点。Zhu等［82］构建了含有糖磷酸化、电子生成和葡萄糖6-磷酸（glucose 6-phosphate，G6P）再生三大模块且不涉及ATP或CoA的多酶途径［图4（b）］。值得注意的是，该途径以G6P作为“通用接口”，将3个功能模块完美对接，通过改变底物能量激活模块中的糖磷酸化酶，可实现对淀粉糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖乃至生物质糖等多种糖的完全利用，体现了合成生物学模块“即插即用”的特性，大大拓展了电池的底物谱。Kim等［83］将3种不同来源的NAD（H）依赖型醇脱氢酶、醛脱氢酶和甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase，FDH）自组装进水凝胶中，可催化1分子甲醇完全氧化同时产生3分子NADH，并用这些还原力进行产电。

图4 基于多酶催化的产物合成途径Fig.4 The multienzyme-catalyzed pathways for product synthesis

3.1 酶的固定

生物催化剂和电极之间的电子传递将生物反应和电化学过程相关联，因而深入研究电子传递机制对于理解氧化还原酶的构效关系至关重要，也是酶促生物电催化反应器、电极和反应过程设计的理论基础。界面电子传递速率高度依赖于酶活性位点与电极之间的表面距离，当该距离低于1.4 nm且不需要任何电子中介体（electron mediator）即可进行电子传递的方式，称为直接电子传递（DET），对于需要电子中介体的则为间接电子转移（MET）［84］。在实际应用中，中介体的电子特性必须与目标生物电催化反应的类型相匹配，如常用的甲基紫精、蒽醌和中性红等［85-87］。

为了提高酶促生物电催化系统性能，需要维持酶的活性及在电极表面的较高浓度，使酶与电极有效耦联，往往需要将酶固定化至电极［88］。酶固定化主要分为吸附（包括共价和亲和）、包埋、交联等。酶在电极表面的吸附本质上是依赖分子间作用力的物理结合策略，如疏水相互作用、范德华力、离子相互作用和共价作用等［89］。常用载体有聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸和聚苯胺［90-92］。吸附法虽然保留了酶的结构和活性并与电极表面建立了良好的亲和力，但由于分子间作用力和对酶的选择性较弱，导致维持时间相对短暂。因此，可以通过对酶-电极表面修饰或酶改造提高酶-电极的亲和力［93］，例如将FDH成功吸附在功能化电极表面［94-96］。包埋则不需要酶和聚合物结构之间的特定作用，通过共价或非共价作用可将酶包裹在聚合物结构中并固定在电极表面［97-98］。最常用的聚合物试剂有Nafion和壳聚糖，此外包括Os电沉积聚合物、甲苯胺蓝以及聚吡咯、聚苯胺在内的导电聚合物也可以促进电极表面和酶活性氧化还原中心之间的直接电子转移［65，99-103］。交联法往往涉及化学试剂，可能使酶结构改变并降低其活性，可考虑掺入惰性蛋白以降低目标蛋白的失活。

氧化还原酶在电极表面的定向固定，可缩短氧化还原酶和电极间的电子传递距离，有时可以将原本不可进行DET的酶实现DET［图5（a）］。酶的改造是实现酶定向固定的有效方法之一，常用方法是给酶表面添一个接头，以提供酶在电极上的定向固定位点［29］（表1）。例如，由C端添加了His-tag的HRP制备的酶多肽吸附金电极，显示出明显的DET特征，并且对H2O2的灵敏度提高了100倍以上［40］。Lee等［41］设计了在N端或C端带有金 结 合 肽（gold binding peptide，GBP）的FADGDH，实现了酶在金电极上的定向固定，从而产生稳定的电流［图5（b）］。除了特异性的定向结合，小分子修饰可能会引起蛋白的构象变化，从而暴露某些结合位点以实现酶的定向固定。此外，通过定点突变引入新氨基酸从而形成新共价键，是实现酶定向固定的另一策略。例如，利用电极表面上修饰的丁烯二酰亚胺基团与在酶表面特定位置引入的半胱氨酸残基耦联形成巯基，可用于胆红素氧化酶的定向固定，并展现出更快的DET与更高的稳定性［42］。以类似方式制备的纤维二糖脱氢酶（cellobiose dehydrogenase，CDH）、漆酶、多铜氧化酶，极大改善了DET型酶促生物电催化的性能，提高了酶与电极的电子传递效率［104-105］。

图5 氧化还原酶的定向固定Fig.5 Directed immobilization of oxidoreductases

除了对酶进行改造，电极修饰材料的选择以及修饰活性官能团也是实现酶定向固定的方式［106-108］。最近Muguruma等［45］研究表明，在金电极上修饰的单壁碳纳米管（single walled carbon nanotube，SWCNT），可以靠近FAD活性中心的凹槽实现FADGDH的有效DET［图5（c）］。针对碳基电极可使用硝酸、硝酸铵、过硫酸铵、乙二胺、4-（N，N-二甲氨基）苯重氮和聚苯胺等进行化学修饰［106-109］。Wang等［43］将NiFe氢酶（PfSHI）固定在4-甲基苄胺修饰的氨基化多壁碳纳米管（multiwalled carbon nanotube，MWCNT）上，证明PfSHI靠近疏水表面时改变了空间构象并且在电极上重新定向。对金属电极进行修饰，可以防止特定氨基酸与裸金属电极相互作用而引起的潜在酶构象变化，并降低电子传递的活化能。CDH［44］、CueO［110］和亚硫酸盐氧化酶［111］的研究结果表明，金属表面形成的自组装单分子层可以调节蛋白质与电极之间的静电作用。此外，有报道将人工去除了辅因子的黄素酶（apoflavoenzymes），例如缺少了FAD的GOx，重组到具有单层辅因子膜的电极表面，制备出了高效DET酶电极［图5（d）］［46，112-113］。

3.2 界面生物电子传递强化

氧化还原酶的改造是常用的调控界面电子传递性能方法（表1）。酶的活性位点通常埋在蛋白质内部，通过删除在C端、N端或Loop区域不维持蛋白质功能和结构的非必需氨基酸残基，可以缩短原始电子传递途径，使活性位点更加靠近电极表面［25］。Wang等［47］构建了截短的只含2个亚基的PfSHI，缩短了酶和电极之间的电子传递距离，表现出比4亚基野生型更高的电子传递速率。也有报道，通过同源建模构建截短的血红素3组成电子转移亚基的FADGDH，可以从原本不能DET变为可以DET［图6（a）］［48］。另一种缩短活性位点与电极之间距离的有效方法是去糖基化。将一些不导电的糖基从氧化还原酶表面移除，使电极表面酶分子量变小，有助于辅基和电极的紧密接触，增强DET的能力［图6（b）］［49］。例如，利用去糖基化后的CDH修饰的石墨电极，底物加入后的最大催化电流比野生型高40%～65%［49］。该策略也应用在GOx和HRP中以提高DET［114-115］。此外，可利用引入UAA的方法来在人工酶中安装氧化还原中心，以优化蛋白质结构域间或酶与电极之间的电子传递。例如，利用硼二吡咯甲烯将特异性掺入非天然氨基酸TF的甘氨酸氧化酶和L-色氨酸氧化酶连接在电极表面，可以促进电子转移实现DET，并构建出相应的生物传感器［图6（c）］［116］。

由于很多氧化还原酶的反应需要价格昂贵的辅酶［如NAD（H）及NADP（H）］的参与，辅酶模块的有效再生也是酶促生物电催化中的关键和难点。其再生方法主要包括酶法、电化学法和光化学方法［117］，电化学法的优势在于成本低、绿色环保、无副产物生成以及无需其他化学反应试剂等，但对还原介质的选择具有一定的局限性，反应时需要较高的电位并可能会导致辅酶二聚体的产生［118］。例如，在生物电催化固氮系统中，阴极基于甲基紫精（methyl viologen，MV）介导了固氮酶和黄递酶的催化反应，电流密度较无MV提高了40%［50］。构建酶-辅酶交联复合体可以拉近辅酶与酶的距离，将其限域在酶周围，有效促进电子传递和辅酶再生。Song等［51］将FDH与NADH共价交联，固定在铜纳米颗粒修饰的电极上，酶电催化固定CO2的法拉第效率为22.8%，比使用FDH和游离NADH高出约2.5倍［图6（d）］。最近，由含氧化还原基团的侧链及非导电主链构成的氧化还原聚合物，在电极修饰策略方面也受到了关注，可促进电子传递［119-120］。氧化还原聚合物主要包括二茂铁和过渡金属配合物以及紫精、醌、Os和2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物等有机聚合物［121］。Mao等［122］设计了一种新型Os2+/Os3+复合物氧化还原水凝胶，间隔连接到聚合物主链，成功将GOx的FAD/FADH2活性位点与电极相连，可以在低至−0.36 V的电位下氧化葡萄糖。然而，这种方法往往需要使用有毒试剂，并且对酶进行化学修饰可能会影响底物或产物的扩散速率。

图6 界面生物电子传递强化策略Fig.6 Strategies of enhancing the electron transfer at the enzyme-electrode interface

酶促生物电催化系统中，电极不仅是电流收集器，还是支撑生物催化剂的基础，涉及固-液或固-液-气非均相氧化还原反应。电极材料应具备出色的导电性和稳定性、高比表面积和机械强度、低成本、环保、耐腐蚀且生物相容等［123-125］。碳基电极是使用最广泛的电极，包括碳纸、碳布、碳网和碳纳米管等［126］，但它赋予电极表面疏水特性，通常会限制氧化还原酶的固定效果，影响界面电子传递。因此，通常会利用金属氧化物纳米复合材料或导电性材料对电极进行表面修饰［127］。例如，利用碳纳米管、纳米粒子等纳米材料的修饰，为酶的附着提供了3D导电框架［123，127］。另一个策略是改变电极的理化性质，以增强酶固定效果和界面电子传递，如通过气体［128］、氰尿酰氯［129］、壳聚糖［130-131］和三聚氰胺［132］等处理。

4.1 酶燃料电池

随着对清洁和可持续能源不断增长的需求，以及可穿戴和可植入电子设备的快速发展，绿色安全和高生物相容性的电池成为研究热点［133-135］。EFC由于使用可再生生物催化剂和高能量密度的燃料，具有较高的生物相容性，得到广泛关注［136-138］（表2）。EFC可以利用糖类［146］、醇类［147］、有机酸类［148］和氢气［149］等多种化合物作为燃料，这些燃料可以来自于生物体自身，或者自然界的生物系统。例如，带有植入EFC的蜗牛将能够在自然环境中运行，可持续性激活生物电子设备，并通过蜗牛进食产生的葡萄糖实现连续运行［150］。Rogers课题组［151］基于EFC设计了一种自供电的无线电子传感设备，具有轻量级、小型化和低成本的优势，可同时监测葡萄糖、乳酸、pH和出汗率。该装置利用Nafion固定的LOx作为生物阳极，涂有镀铂碳的金电极作为阴极，产生的电压信号与葡萄糖浓度成正比。此外，在两天内对两名受试者检测显示，汗水和血液中的葡萄糖和乳酸浓度之间有良好的一致性，为无创、半定量的人体健康监测奠定了基础。

表2 酶生物电催化应用系统Tab.2 Application systems of enzymatic bioelectrocatalysis

续表2

续表2

EFC的能量密度和功率密度对于其应用至关重要。大多数葡萄糖EFC基于GOx或GDH，每分子葡萄糖实际上仅产生理论24个电子中的2个［152-153］。Zhu等［66］通过多酶催化途径，首次实现了糖底物的完全氧化，意味着以0.15 kg/L麦芽糊精为燃料的EFC可具有596 A·h/kg的储能密度。Shi等［154］近期还实现了生物质中的葡萄糖和木糖到电能的完全转化，意味着通过EFC有望从自然界广泛存在的生物质糖获取绿色和便捷的电能。此外，为了提高EFC的输出功率（包括电压和电流的提升），研究者从氧化还原介质开发、电极材料创制、酶定向固定等多个方面进行了一系列尝试。例如，通过结合吩噻嗪或醌类衍生物修饰的氧化还原聚合物生物阳极，可以将葡萄糖/氧气EFC的开路电压（open circuit potential，OCP）提高至0.6～0.8 V［155］。基于萘醌作为电子中介体并替代氧化还原聚合物水凝胶，能够在低电位下促进GOx氧化葡萄糖，达到5400µA/cm2的最大电流密度。然而，这些氧化还原介质会影响生物相容性、稳定性和增加成本［134，156］。从这个角度看，开发低氧化还原电位、高生物相容性和稳定性、良好的传质渗透性和对酶高亲和力的氧化还原聚合物具有重要意义。除了导电材料，酶的结构与种类对电池性能也很关键。例如，FeFe氢酶相比于NiFe氢酶催化H2产电的过程更加容易被氧气不可逆影响，从而使相应的EFC性能衰退［157］。FADGDH相比于其他GDH类型会表现出较低的氧化还原电位，其EFC能实现更高的功率输出［158-159］。此外，在氧化还原辅因子中，FAD与酶结合更紧密，不会随着时间的推移而解离，使酶的稳定性更好，EFC稳定性也更佳［160］。像CDH这类含有作为内置负责电子传递的细胞色素结构域从而可以DET的酶，在EFC中越来越得到关注［161］。通过定向固定、酶工程或电极表面修饰，使酶或辅因子更接近电极表面，也是提高生物电极电流密度的重要策略。

4.2 电化学生物传感器

电化学生物传感器（electrochemical biosensor）是商业上最成功的生物传感器之一，广泛应用于临床诊断、食品工业、生物技术、环境监测等领域［139-141］（表2）。因其低成本、相对快速和简单的分析过程以及小单元的测量尺寸而广受欢迎［162-166］。通常，其依赖于酶催化反应的瞬时性、对底物的高度特异性和相对稳定性，通过氧化或还原特定底物产生电子并转移至电极表面，再根据检测到的电信号将分析物浓度输出为可量化信号［167-168］。生物传感器的类型主要分为电流式、电位式、电导式和阻抗式［169-173］。根据其电子传递机制，生物传感器分为3代：第1代为采用氧化酶，基于氧化产生的过氧化氢形成电流响应来检测。第2代为利用合适的电子中介体在酶与电极之间通过MET来产生电流响应。如市售的FreeStyle Libre血糖仪，利用Os复合体作为电子中介体连接GOx与工作电极，在40 mV（vs.Ag/AgCl）的电位下氧化葡萄糖进行血糖监测［174］。第3代生物传感器基于可以DET的氧化还原酶，无需电子中介体就可以在较低的电势下运行，且其特异性受抗坏血酸等电活性干扰物的影响较小。由于并非所有的氧化还原酶都能够进行DET，与现有的第1代和第2代生物传感器相比，现仅存在一种市售的第3代生物传感器（LactoSens）［175］。

开发第3代生物传感器是现在的研究热点，其性能关键取决于DET速率［142-143］。DET加快可提高转化数和灵敏度及降低检测限，还有助于减小极化电位，从而减少工作电极上的干扰反应、提高传感器选择性。目前研究集中在含FAD、FMN、血红素、PQQ、钼、铁硫簇或铜为辅基的氧化还原酶与电极的DET上。用于过氧化氢检测的第3代生物传感器采用多晶金电极搭配重组HRP，其灵敏度为1400 µA·L/（mmol·cm2）［176］。烟草过氧化物酶与HRP相比，具有更广pH范围的适应性及更高的灵敏度，在硫醇修饰的金电极上固定过氧化物酶产生了高出多倍的电流［177-178］。Shipovskov等［179］在具有自组装单层（self-assembled monolayer，SAM）或Os聚合物的修饰金电极固定茶碱氧化酶，相关生物传感器检测茶碱的灵敏度分别为52.1µA·L/（mmol·cm2），检测范围为3.6～72 mg/mL。由于CDH具有进行DET的能力且底物特异性高，通过适当的酶改造，除了纤维二糖，还可用它实现乳糖的检测［180-182］。例如，Gorton等［180］将分散在壳聚糖溶液中的高介孔碳气凝胶固定在玻碳电极表面，制备基于CDH的乳糖生物传感器灵敏度为133.7µA·L/（mmol·cm2）。

4.3 酶电合成

与通过在阳极氧化燃料产生电子的EFC相反，EES通常在阴极通过电能驱动底物被酶催化还原为产物［183］，根据电子传递不同也分为DET和MET［184］。单酶生物电合成系统主要用于合成简单化合物或引入官能团和手性中心，而多酶级联的生物电合成系统可执行多步转化过程和复杂结构产品的合成［145］（表2）。

目前，EES可利用的底物包括CO2、N2、NO2−、醇类等，而产物包括甲酸盐、甲醇、NH3、H2和烷烃，以及一些高附加值的化学品和药品。例如，含有活性金属中心Mo［185-186］或W［187-188］的FDH可有效用于酶电催化还原CO2，能以优异的反应速率进行甲酸合成。这些酶通常来自厌氧极端微生物，并涉及复杂的多域电子传递机制。除了甲酸，甲醇也可通过模拟自然光合作用和依赖多酶途径的酶促光电化学池中由CO2合成［189］。近期报道的通过钒固氮酶的VFe蛋白将CO2还原形成C－C键变为乙烯和丙烯的研究，为CO2转化成碳氢化合物提供了一种新的路线［144］。N2也可作为酶促生物电催化的底物，可通过固氮酶实现N2还原为NH3

［20，190］。例 如，Lee等［191］利 用 固 氮 酶 的MoFe蛋白实现了H+到H2、N3−到NH3、NO2−到NH3的生物电催化反应。鉴于EES通常需要氧化还原介质，会导致大量的过电位和复杂的酶动力学，Hickey等［192］设计了一个以DET模式将N2生物电合成NH3的系统。其他产品的EES也有相关报道。例如，利用醛脱甲酰加氧酶从醛和醇中进行酶促电合成辛烷到丙烷的一系列烷烃［193］。基于辅因子再生的EES应用也越来越多，例如L-谷氨酸的光电合成［194］、利用D-乳酸脱氢酶生产D-乳酸［195］以及对映选择性酮还原和还原胺化反应［196］等。EES也在生产高附加值化学品中展示了巨大潜力，包括氨基酸［197］、左旋多巴［198］、R-左旋二酮［199］、聚羟基丁酸酯［69，200］和R-L-苯基乙醇［201］等。

在这篇综述中，我们讨论了酶促生物电催化的合成生物学构建及应用。蛋白质工程是提高生物电催化剂性能的有效方法。MET和DET是两种主要的电子传递机制，对酶促生物电催化系统的设计至关重要。电极材料和修饰方法的发展提高了生物电催化器件和系统的性能。近年来，酶促生物电催化已广泛应用于生物传感器、生物电能和化学品的合成，虽然其潜力巨大并且取得了一些突破性进展，但仍需要发展适用于相关工程应用的基础理论和技术方法，以促进其市场化应用。

合成生物学作为生物化学、计算机和工程学等多学科相融合的交叉学科，结合了生物学的研究性质和工程设计原则，在生物医药、天然产物、生化产品和生物能源的生产等领域都有重要指导作用［202］。虽然以氧化还原酶为催化剂的生物电催化系统已经取得了显著成果，但在实际应用中仍然面临巨大挑战，如电子传递速率低、酶稳定性差、成本高等。未来的研究可从以下3个方向来进行：

（1）设计改造电活性生物元件在酶促生物电催化系统中，氧化还原酶是催化目标底物转化以及电子传递的核心元件。设计改造氧化还原酶的活性中心以提高电子传递速率和效率的研究应是未来的重点方向［203］。除了通过蛋白质工程对氧化还原酶本身进行设计和改造，开发更多电活性生物元件，也有助于促进界面电子传递和关于电催化机理的深入研究［204］。此外，需要开发更多适用于电活性生物元件的设计与改造方法，包括针对于氧化还原电势的高通量筛选、基于电耦合强度计算的蛋白电子通道设计等。随着AlphaFold等新技术的涌现，更多的酶结构可被预测，也为设计电活性生物元件提供了更多可能。

（2）拓宽反应电势/电压受生物化学反应电势的限制，酶促生物电催化系统的实际应用也存在一些问题，例如电池输出电压小、电合成电势窗口窄等。传统燃料电池的串联组装可用于EFC的输出电压放大，同时拓展EES的电势范围，而并联连接可增加电流密度［134］。例如通过5个独立电池串联而成的丝网印刷EFC，其产生的电压可直接点亮LED灯［205］。然而，通过串联的系统整体性能会受最差单元的限制。因此，系统的堆叠需要可控、可重复，尤其是在材料的制备和酶的固定化方面。利用金属引线串联时，需要避免离子导电电解质引起的短路，如采用超疏水表面为电解池或电池之间建立离子隔离等。除串联外，还可通过连接电荷泵作为DC-DC转换器来提高系统输出电压。例如，采用升压转换器后，可实现将葡萄糖/O2型EFC提供的能量较低的电子转化为能量较高的电子，并用于电解水［206］。此外，降低电催化反应的过电势也是酶促生物电催化系统的研究重点。例如，将CO2电还原与甘油电氧化相结合，可降低反应槽电压、节省反应耗电量、降低成本并获得高附加值还原产物［207］。

（3）反应器和系统放大在酶促生物电催化系统中，生物元件、电极材料、电子中介体等共同构成了一个复杂的系统。除聚焦生物本身的特性和工程改造之外，电极材料的理化特性、表面结构、生物相容性等对酶-电极相互作用和生物电催化系统的性能也起着至关重要的作用。已开发出很多具有新结构、特性和功能的先进电极材料，可增强生物催化剂和电极之间的电化学通信［123-124，208-209］。根据不同酶元件的结构特性，构建高生物相容性的有机/无机-生物杂合系统，可以进一步拓宽生物电催化系统在电能输出、电化学合成、生物传感等领域的应用范围。目前，酶促生物电催化系统仍处于实验室水平，除受酶活性和稳定性、多酶催化电子传递效率等问题的限制外，最大的问题之一是反应器难以放大。扩大系统的电极面积或反应器体积，其功率无法成比例提升，反而会增大系统内阻、徒增损耗，不利于整体性能的提高。电极的三维化是提高其比表面积、增大电流的有效手段。在反应器层面，实验室规模上常用的反应器是H型两室反应器，但由于高内阻限制了扩大到中试或工业规模的可能［210］。相比于H型池，基于膜电极组的流动型电解池具有更高的通量，可实现连续化生产，更加适用于工业化大规模应用。另一方面，随着可穿戴、柔性化等应用需求的增多，迫切需要设计和开发种类繁多的新型酶促生物电催化反应器以及合理的放大策略，以便更好地表征、建模、优化和应用于不同的系统［211］。决定酶促生物电催化系统能否进入实际应用的另一关键因素是能量转化中的效率和成本问题。除电极材料和酶的成本需进一步降低外，随着合成生物学元件的开发和创新，采用更廉价、更稳定的仿生辅酶或开发高效的生物电催化辅酶再生的方法有望有效降低成本，简化产品分离过程，并延长系统运行时间。

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