浸润性乳腺癌患者组织P120ctn,p53及CK5/6表达及意义分析

林伟强， 袁惠玲， 温润耀， 叶建森， 张爱玲

(南方医科大学附属东莞医院/东莞市人民医院乳腺科， 广东 东莞 523000)

乳腺癌是女性高发恶性肿瘤，其中以浸润性乳腺癌(invasive breast carcinoma,IBC)多见，因IBC容易出现局部复发、转移，有关其研究备受重视[1]。P120连环蛋白(catenin,P120ctn)为连环蛋白家族成员之一，可参与细胞信号传导、黏附作用等过程，其异常表达与恶性肿瘤侵袭、转移有关[2]。p53基因是人体重要的抑癌基因，正常情况下其编码的野生型p53蛋白可通过诱导凋亡、帮助基因修复参与肿瘤抑制过程，但突变型p53蛋白则丧失诱导细胞凋亡能力，与细胞恶性转化有关，因此p53蛋白在恶性肿瘤诊断、预后评估中有一定应用[3]。细胞角蛋白5/6(Cytokeratin5/6,CK5/6)是一种基底细胞角蛋白，与上皮细胞的增殖分化关联密切，在维持上皮组织连续性、完整性中起重要作用[4]。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NAC)在恶性肿瘤治疗中十分普遍，其主要目的在于缩小肿瘤病灶、杀灭转移癌细胞，从而为后期局部手术或放疗奠定良好基础，早期预测NAC疗效可为临床诊疗方案制定提供参考[5]。为此，本研究采用免疫组化法分析了IBC患者癌组织P120ctn、p53、CK5/6表达情况，旨在探究其与临床病理特征、NAC疗效关系，从而为后期IBC患者预后评估及诊疗方案制定提供依据。

1.1一般资料：回顾性分析2018年10月至2021年10月120例女性IBC患者临床资料。纳入标准：①均经穿刺活检或术后病理明确IBC诊断，即显微镜下见癌细胞侵入乳腺导管、基底膜和间质的乳腺癌类型；
②入院前无任何抗乳腺癌治疗；
③适合行NAC者，即临床分期ⅡA、ⅡB、ⅢA(仅T3、N1、M0)希望缩小肿块、降期保乳者，或临床分期ⅢA(不含T3、N1、M0)、ⅢB、ⅢC期者，且术前均接受规范NAC；
④留存足够行免疫组化分析[一般厚度0.3cm、面积(1.0～1.5)cm×(1.0～1.5)cm]的癌组织、癌周组织标本；
⑤临床病理资料完善。排除标准：①肿瘤复发者或其他部位恶性肿瘤转移者；
②入组时已发生远处转移者；
③合并免疫疾病、血液病、内分泌疾病、急慢性感染等其他严重疾病者；
④未按规定完成NAC治疗者；
⑤特殊类型乳腺癌或男性乳腺癌患者。120例患者年龄28～79岁，平均(55.74±11.35)岁；
乳腺癌分子分型Luminal A型[雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptormPR)阳性，人类表皮生长因子受体-2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阴性，肿瘤增殖抗原Ki-67<14%]27例，Luminal B型(ER阳性和/或PR阳性，HER2阴性、Ki67≥14%；
或ER阳性和/或PR阳性，HER2阳性，无论Ki67表达如何)62例，HER-2过表达型(ER阴性、PR阴性、HER2阳性)19例，三阴性(ER阴性、PR阴性、HER2阴性)乳腺癌12例；
临床分期：Ⅱ期56例，Ⅲ期64例。

1.2方 法

1.2.1临床资料收集：收集患者临床病理资料，包括年龄、是否绝经、肿瘤直径、分子分型、组织学分级、淋巴结转移、临床分期等。

1.2.2免疫组化

1.2.2.1主要试剂和仪器：P120ctn、p53、CK5/6鼠抗人单克隆抗体及二抗试剂盒均购自上海信裕生物科技有限公司；
EDTA抗原修复液、DAB显色剂购自北京百奥莱博科技有限公司；
MY2300型全自动免疫组化染色机购自上海精密仪器仪表有限公司，Olympus BX53光学显微镜购自上海普赫光电科技有限公司。

1.2.2.2免疫组化检测：组织标本均经4%中性甲醛固定，常规制作4μm厚石蜡切片，免疫组化染色采用EnVision二步法，主要步骤：二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，EDTA法高温高压抗原修复，3%H2O2行过氧化氢酶阻断，1%BSA封闭非特异性抗原，滴加一抗(P120ctn、p53、CK5/6鼠抗人单克隆抗体，4℃孵育过夜)，滴加二抗(常温孵育1h)，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片；
切片均设阳性(已知阳性标本)和阴性对照(PBS缓冲液代替一抗)。

1.2.2.3结果判定：先于低倍镜下观察染色，找到合适视野后，随机选取5个视野(≥100个细胞)，p53、CK5/6于400倍镜下观察染色强度和阳性细胞表达(阳性细胞数/总细胞数×100%)，其中p53以细胞核着色为阳性，CK5/6以细胞膜或细胞质着色为阳性，A染色强度分为不着色(0分)、浅黄色(1分)、棕色或黄色(2分)、深棕色或棕褐色(3分)，B阳性细胞表达可分为<5%(0分)、5～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)；
最后积分取5个视野平均值，其中A×B≥2分为阳性表达，否则为阴性表达。P120ctn观察细胞膜、细胞质染色情况，正常情况下P120ctn定位于细胞膜，着色后呈棕黄色，正常细胞P120ctn膜阳性细胞率>75%，而肿瘤细胞P120ctn膜表达下降、细胞质表达升高，当P120ctn胞质比率>10%时视为阳性表达。结果判断由2名均有具有中级及以上职称病理科医师采用双盲法进行诊断，结论不一致时协商达成一致。

1.2.3NAC方案及疗效评价：参考2019年版《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范》[5]行NAC治疗，均采用TAC方案，即多西他赛(75mg/m2，静滴，d1)+多柔比星(50mg/m2，静滴，d1)+环磷酰胺(500mg/m2，静滴，d1)方案，以21d为1个周期，共6个周期，各周期均采用粒细胞集落刺激因子支持。于第2个周期末评估NAC疗效，采用磁共振检查，参考实体瘤疗效评价标准1.1版[6]分为完全缓解(complete remission,CR)、部分缓解(partial response,PR)、疾病稳定(stable disease,SD)和疾病进展(progression disease,PD)，统计有效率，即(PR+CR)/总例数×100%。PR患者继续行2个周期NAC，然后于3周内行手术治疗，CR、SD、PD患者改行手术，其中CR、PR者手术后继续完成原化疗方案；
SD、PD术后更换其他化疗方案。

1.3统计学分析：应用SPSS24.0软件，用n(%)表示计数资料，比较采用χ2检验；
相关性分析采用Spearman秩相关法；
影响因素分析采用多因素Logistic回归分析；
P<0.05表示差异有统计学意义。

2.1癌组织与癌周组织P120ctn、p53及CK5/6阳性表达率比较：癌组织P120ctn、p53及CK5/6阳性表达率均显著高于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织与癌周组织P120ctn p53及CK5/6阳性表达率比较n(%)

2.2癌组织P120ctn、p53及CK5/6表达与临床病理特征关系：P120ctn阳性表达率与分子分型、淋巴结转移有关(P<0.05)，与年龄、是否绝经、肿瘤直径、组织学分级、临床分期无关(P>0.05)；
p53与肿瘤直径、分子分型、组织学分级、淋巴结转移、临床分期有关(P<0.05)，与年龄、是否绝经无关(P>0.05)；
CK5/6与分子分型、组织学分级有关(P<0.05)，与年龄、是否绝经、肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期无关(P>0.05)。见表2。

表2 癌组织P120ctn p53及CK5/6表达与临床病理特征关系n(%)

2.3癌组织P120ctn、p53及CK5/6表达相关性：Spearman秩相关分析显示，癌组织P120ctn与p53、CK5/6表达均呈正相关(r=0.384、0.406)，p53与CK5/6表达呈正相关(r=0.581)，均有统计学意义(P<0.05)。

2.4术前NAC疗效：120例患者术前经2个周期NAC后，有27例(22.50%)达CR，49例(40.83%)达PR，34例(28.33%)SD，10例(8.33%)发生PD，有效率为63.33%(76/120)。

2.5影响患者NAC疗效的单因素分析：单因素分析显示，肿瘤直径>2cm、组织学分级G3、淋巴结转移、P120ctn阳性表达、p53阳性表达、CK5/6阳性表达者有效率较低(P<0.05)；
但患者年龄、是否绝经、分子分型、临床分期与NAC疗效无关(P>0.05)。见表3。

表3 影响患者NAC疗效的单因素分析n(%)

2.6影响患者NAC疗效的多因素Logistic回归分析：多因素Logistic回归分析显示，淋巴结转移、P120ctn表达阳性、p53表达阳性是影响患者NAC疗效的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响患者NAC疗效的多因素Logistic回归分析

P120ctn最早是作为Src激酶底物被发现，其可通过与钙粘蛋白胞浆近膜端结合成钙粘蛋白-连环蛋白复合物，从而增强钙粘蛋白稳定性，参与细胞黏附、侵袭、迁移等行为调节；
胞质中P120ctn能通过诱导Ras同源基因家族成员A蛋白活化，增加应力纤维形成，从而促进肿瘤细胞迁移；
P120ctn还能与转录因子Kaiso相互作用，参与wnt信号通路中某些基因转录调控[7]。已有文献指出[8]，P120ctn对浸润性导管乳腺癌远处转移、定植有很强的促进作用。本文结果显示，IBC患者癌组织P120ctn阳性表达率明显升高，且与患者分子分型、淋巴结转移有关有关，提示P120ctn可参与IBC发生发展过程，与沈倩等[9]报道相似。

p53基因是迄今发现和人恶性肿瘤关联度最高的基因，其编码的p53蛋白由393个氨基酸组成，可通过介导转录激活参与细胞周期阻滞、促进细胞分化、诱导凋亡过程，发挥抑制肿瘤细胞增殖作用；
但p53基因在内外因素刺激下突变频繁，而突变p53蛋白失去正常野生型p53蛋白功能，反而有损伤正常细胞DNA、促进细胞异常增殖作用。因突变p53蛋白半衰期延迟，可在组织大量积聚，经免疫组化检测的p53蛋白一般是突变的p53。既往有报道指出[10]，p53在结直肠腺癌癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织。本研究发现，IBC患者癌组织p53阳性表达率明显高于癌旁组织，且p53与肿瘤直径、分子分型、组织学分级、淋巴结转移、临床分期有关。袁明明等[11]研究认为，p53在浸润性乳腺癌组织中高表达占比较高，且与患者分子分型、组织学分级有关，支持本研究结果。

细胞角蛋白是主要分布于上皮细胞胞质的骨架蛋白，其与其他胞质内辅助蛋白形成的复杂网络系统可源于核膜、横跨胞质至上皮细胞间，因此能维持上皮组织连续性、完整性，其中CK5/6是指分子量为58kDa、56kDa的细胞角蛋白，可于乳腺腺中间细胞、定向肝细胞、肌上皮中间细胞表达，CK5/6异常升高可能提示上皮细胞癌。本文研究显示，IBC患者癌组织CK5/6阳性表达率升高，且与分子分型、组织学分级有关，提示CK5/6可参与IBC发展。陶玉梅等[12]报道指出，CK5/6在IBC患者癌组织中阳性表达率较高，且以三阴性乳腺癌中表达最高，其表达阳性意味着恶性程度更高、侵袭性更强、预后更差，而且CK5/6还与表皮生长因子受体表达呈正相关，与本研究有相似之处。

NAC在乳腺癌治疗中占重要地位，通过NAC不仅可获得患者药敏反应信息，为后期治疗提供参考，还能对乳腺癌降期，使患者手术治疗或保乳手术治疗成为可能，因此早期预测NAC疗效对临床诊疗方案制定十分重要。本文结果显示，120例患者术前经2个周期NAC后，有效率可达63.33%，其中淋巴结转移、P120ctn及p53表达阳性是影响患者NAC疗效的危险因素，提示P120ctn、p53或许可作为IBC患者NAC的疗效预测指标，这可能与P120ctn、p53能介导肿瘤耐药性有关，值得深入研究。不过本研究并未发现CK5/6对患者NAC疗效影响，可能因为CK5/6并非是影响患者化疗敏感性的因素，这一结果也可能受研究样本选择影响，后期可扩大样本、进行多中心研究。上述结果提示临床，通过P120ctn、p53靶向调控或可以抑制乳腺癌侵袭、转移，改善患者预后，这为后期乳腺癌治疗靶点发掘提供了新思路。此外，本研究还发现，癌组织P120ctn、p53及CK5/6表达互呈正相关，提示P120ctn、p53、CK5/6在IBC发生、发展中可能存在一定协同作用。本研究不足之处在于，受随访时间限制，未分析P120ctn、p53及CK5/6表达与患者远期预后关系，后期完善随访后可进一步探究。

综上所述，IBC患者癌组织P120ctn、p53、CK5/6阳性表达率明显升高，且均与患者临床病理特征表现出一定相关性，其中P120ctn、p53阳性表达是影响患者NAC疗效的危险因素，可能作为IBC患者NAC疗效的早期预测指标加以探究。

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