基于网络药理学和实验验证探讨土荆皮治疗浅部真菌病的作用机制

袁芳草，吴 然，李 倩，张丹林，彭 超，唐姗姗

（1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002；
2.贵州中医药大学第一附属医院皮肤科，贵州 贵阳 550001）

浅部真菌病（Superficial mycosis）是一种真菌疾病，其病灶主要局限于皮肤、指甲或头发的外层，但可能会侵入更深层的组织[1]。此病由皮肤癣菌、霉菌、酵母菌和酵母样真菌引起，会对患者的心理和社会心理因素产生负面影响，并降低其生活质量，是全世界重点关注的健康问题[2]。目前由于抗真菌药物在浅部真菌病治疗中的广泛应用，有关抗真菌药物耐药性的报道不断增加，抗真菌药物耐药性的增加正在成为一个公共卫生挑战[3]。中医药治疗浅部真菌病历史悠久，中药外治浅部真菌病的疗效可与西医抗真菌药媲美，且具有不良反应少和复发率低的优势[4]。土荆皮（Pseudolarix kamepferi）又名土槿皮，为我国特有松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮，始载于赵学敏的《本草纲目拾遗》，具有杀虫止痒、祛风除湿的功效[5]。土荆皮的多种化学成分具有抗肿瘤、抗血管生成、抗真菌等活性[6]，其中抗真菌活性应用前景广阔，是目前研究的热点。本研究通过网络药理学结合体外实验对土荆皮治疗浅部真菌病的效果进行研究，旨在为浅部真菌病的中药治疗提供理论基础。

1.1 菌种和药物

红色毛癣菌由贵州医科大学附属医院皮肤科馈赠；
土荆皮饮片购自贵州中医药大学第一附属医院药房。

1.2 试剂和仪器

马铃薯琼脂培养基（PDA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）购自青岛海博生物技术有限公司；
氯霉素购自北京索莱宝科技有限公司。恒温培养箱（美国致微ZWALWAY 产品）；
显微镜（瑞士TECAN 公司产品）；
麦氏比浊仪（北京海富达科技有限公司产品）；
玻璃冷凝管回流装置（山东禹王公司产品）；
真空干燥箱（天津鑫州仪器有限公司产品）。

1.3 土荆皮成分和靶点的筛选

在TCMSP 数据库平台输入土荆皮作为关键词进行检索，将OB 值≥30% 和DL 值≥0.18 作为筛选标准。将筛选出的有效成分上传至PubChem 数据库中得到对应的SMILES 号，随后通过SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测，将得出的所有靶点进行去重整理，并通过Cytoscape 软件进行可视化分析。

1.4 土荆皮治疗浅部真菌病的有效靶点

将Superficial mycosis 作 为 关 键 词，通 过GeneCards 疾病数据库进行检索，即得出浅部真菌病的靶点。将得出的土荆皮靶点和疾病靶点进行交集处理，得出的靶点为土荆皮治疗浅部真菌病的有效靶点。

1.5 构建PPI 网络

将得到的土荆皮治疗浅部真菌病的有效靶点上传至STRING 数据库中，将其生物物种设置为H.sapiens，根据所需要求导出TSV 格式上传至Cytoscape 软件对得出的结果进行可视化分析。

1.6 GO 分析和KEGG 通路分析

通过Metascape 数据库对土荆皮治疗浅部真菌病的有效靶点进行GO 和KEGG 分析，并设置物种选项为H.sapiens 和P＜0.01，并 通 过Cytoscape 软 件 构建出成分- 通路- 靶点图。

1.7 土荆皮醇提物对红色毛癣菌的抑菌实验研究

1.7.1 药物提取 先将土荆皮粉碎成粗粉，并置于无水乙醇中浸泡5 ～6h（无水乙醇：药材为10：1），通过回流冷凝法提取1h，并用绢布过滤，得出药液。再向药渣中加入8 ～10 倍体积的无水乙醇，浸泡、加热回流提取并过滤。将得到的两次乙醇液混合，加热过滤，并进行减压干燥。置于-20℃环境中冷冻至少24h，然后通过进行真空冷冻干燥得出提取物。

1.7.2 药敏实验 取PDA 培养基和氯霉素溶于蒸馏水中，高温高压灭菌，备用。将封存的红色毛癣菌菌种接种于制备好的PDA 培养基中，置于28℃的恒温培养箱中培养7d。用棉拭子蘸取活化后的菌种溶于3mL 的生理盐水中，用比浊仪将浓度调至0.5 麦氏（1×106～6×106cfu/mL），再用生理盐水稀释至1×103～6×103cfu/mL，备用。取SDA 培养基和氯霉素溶于蒸馏水中，灭菌后制含药培养基备用。将1g土荆皮醇提物用1mL 无水乙醇和9mL 生理盐水进行溶解，取2mL 药液用二倍稀释法分别稀释为50 mg/mL至0.097 mg/mL 共10 个浓度。分别加入12 孔板中，随后各孔均加入100μL 浓度为1×103～6×103cfu/mL的菌液。阳性对照组加菌液不加药液，空白对照组不加菌液和药液，最后在各孔加入1mL 的SDA 培养基。于28℃恒温培养箱中孵育7d，当阳性对照组生长出菌丝时，肉眼观察加药组没有菌落生长的最低药物浓度为MIC，实验重复三次。

2.1 土荆皮的有效成分及靶点的预测

通过TCMSP 数据库筛选出OB 值≥30%、DL值≥0.18 的有效成分共8 种，由于土荆皮丙酸无对应靶点，最终符合要求的成分为7 种，见表1。采用SwissTargetPrediction 数据库预测以上7 种有效成分的药物靶点，对其整理后去重得出土荆皮的109 个靶点，上传至Cytoscape 软件构建出成分—靶点网络图，见图1。

图1 成分—靶点网络图

表1 土荆皮的有效成分

2.2 土荆皮治疗浅部真菌病的靶点获取和PPI 网络的构建

通过GeneCards 数据库获得浅部真菌病的靶点421 个，将土荆皮和疾病的靶点进行交集处理得出治疗的有效靶点共17 个。将土荆皮治疗浅部真菌病的17 个靶点上传至STRING 数据库中，得出的PPI 网络包含17 个节点、39 条边，平均节点度为4.59。导入Cytoscape 软件中进行可视化，见图2。图中可见IL2、HSP90AA1、NOS2 等为关键靶点。

图2 土荆皮治疗浅部真菌病的靶点PPI 分析

2.3 GO 分析和KEGG 分析

将土荆皮治疗浅部真菌病的17 个治疗靶点导入Metascape 数据库中进行GO 分析和KEGG 分析。GO分析的结果显示，治疗靶点主要与缺氧反应、蛋白质转运的调节、白细胞介素-6 产生的正调节、氧化还原酶活性、转录调节复合物等相关。KEGG 通路分析得出的通路为癌症的途径、CLRs 信号通路、恰加斯病、Th17细胞分化。将相关的药物成分和靶点上传至Cytoscape中进行可视化分析，得出成分—靶点—通路图，见图3。

图3 土荆皮治疗浅部真菌病的“成分—靶点—通路”图

2.4 土荆皮醇提物对红色毛癣菌的抑菌实验研究

在12 孔板的1 ～10 号孔中分别加入10 个浓度的土荆皮醇提物，并设置空白对照组（-）和阳性对照组（+）。将12 孔板置于28℃恒温培养箱中培养7d。培养观察至第7d 后，结果显示土荆皮醇提物对红色毛癣菌有明显抑制作用，最小抑菌浓度（MIC）为1.562 mg/mL，见表2、图4。

表2 土荆皮醇提物对红色毛癣菌的抑菌作用

图4 土荆皮醇提物对红色毛癣菌抑制作用的镜下观察

在TCMSP 数据库中筛选出土荆皮的主要成分为桦木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黄素等。桦木酸作为一种三萜类化合物，在浓度为8 ～128μg/mL 的范围内可达到杀灭真菌的效果。桦木酸的哌嗪基衍生物表现出与特比萘芬相似的抗真菌谱，并且是抗皮肤真菌最有效的衍生物[7]。有研究发现β- 谷甾醇是一种具有广泛抗真菌活性的植物代谢产物，可通过结合Osh4蛋白达到抗真菌的效果[8]。国外研究表明芒柄花黄素对白色念珠菌、新生隐球菌、热带念珠菌等真菌都表现出良好的抗真菌活性，MIC 值为25 μg/mL[9]。PPI网络分析的结果显示，IL2、HSP90AA1、NOS2 等为关键靶点。研究表明，由皮肤癣菌、足马杜拉分枝菌等真菌感染引起的浅部真菌病患者的血清中，细胞因子IL-2、IL-4 的表达水平明显提升。另有动物实验表明，由须癣毛癣菌建立的动物浅部真菌感染模型中，血清中IL-2、IL-6 的水平明显升高[10]。HSP90 类蛋白在病原菌的生长、毒力以及药物耐药性等方面具有多重调控作用，靶向HSP90 在抗真菌治疗中有着巨大的潜力，研发选择性作用于真菌HSP90 的治疗药物具有广阔的前景[11]。田珂[12]通过临床观察得出，红色毛癣菌感染的甲真菌病患者外周血血清中NO 及NOS 的表达下降，这可能是导致感染易反复的原因之一。GO 分析显示土荆皮主要通过缺氧反应、蛋白质转运的调节、白细胞介素-6 产生的正调节等途径对浅部真菌病产生作用。KEGG 分析得出土荆皮治疗浅部真菌病的通路主要为癌症的途径、CLRs 信号通路、Th17 细胞分化等。目前有研究发现癌症与真菌感染有着密切的联系，白色念珠菌引起的感染能够通过产生致癌副产物、引发炎症、诱导Th17 反应等促进癌症的发生发展[13]；
而且，癌症病人的免疫力低下，更易出现浅部真菌感染。CLRs 信号通路与浅部真菌病联系密切，在真菌感染期间，CLRs 和Toll 样受体(TLR)可通过识别各种真菌表面成分在宿主防御真菌病原体中发挥重要作用[14]。Th17 途径的一些关键要素可被皮肤癣菌激活，如Th17 途径的刺激可以通过抗原呈递细胞中一些CLRs 受体和炎症小体的激活而发生，进而参与皮肤癣菌免疫反应[15]。另有临床研究表明，真菌感染患者会出现Th17、Th17/Treg 水平的明显降低，Th17/Treg 免疫失衡是真菌入侵机体的重要途径[16]。红色毛癣菌是诱发浅部真菌病的主要病原体之一，本次体外抑菌实验的结果显示土荆皮的醇提物对红色毛癣菌有明显的抑制作用，最小抑菌浓度为1.562 mg/mL。有研究指出，土荆皮醇提物可通过抑制菌丝及孢子生长或破坏菌丝形态来抑制红色毛癣菌的活性。近年来，中药抗真菌作用是临床研究的热点。高璐等[17]研究发现，知母水提物对红色毛癣菌有着明显的抑制效果。刘登宇等[18]发现，白鲜碱对红色毛癣菌的抑菌机制可能与抑制细胞膜结构的完整性、降低耐药性等途径有关。

本研究通过网络药理学分析发现土荆皮治疗浅部真菌病的主要起效成分为桦木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黄素等。此药通过作用于IL2、HSP90AA1、NOS2等靶点以及对CLRs 信号通路、Th17 细胞分化等通路的调节来发挥对浅部真菌病的治疗作用。体外抑菌实验表明土荆皮对红色毛癣菌有着明显的抑制作用，其机制与抑制菌丝及孢子生长相关。本研究为治疗浅部真菌病提供了新的思路和方向，同时也为土荆皮的开发利用奠定了坚实的理论基础。

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