TOLL样受体抗体对鼠疟疾病理进程的影响:疟原为啥非洲人对疟疾有抗体

　　摘要：利用ＴＯＬＬ样受体抗体（ＴＬＲｓ）尾静脉注射并封闭对应ＴＬＲ的方法，观察疟疾病理进程的变化。结果表明，ＴＬＲ２、９、１１抗体处理后小鼠的存活率在第１０天分别为７０％、０、０，对照组为５０％；ＴＬＲ２、９、１１抗体处理后小鼠的红细胞感染率峰值分别为５５％、６１％、５８％，对照组为５２％。抗体封闭ＴＬＲ２后，可提高小鼠的存活率；抗体封闭ＴＬＲ９、１１后，小鼠红细胞感染率显著升高而存活率显著降低。证明ＴＬＲ是一类有潜力的抗疟药物或治疗辅助药物的靶点。
　　关键词：疟疾；尾静脉注射；ＴＯＬＬ样受体；抗体
　　中图分类号：Ｒ３９２．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1364-03
　　
　　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｎｔｉ－ＴＬＲｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ｍａｌａｒｉａ ｉｎ Ｒｉｃｅ
　　
　　ＳＵＮ Ｆｅｉ１，ＸＵ Ｂｉｎｇ－ｈｏｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌｉｎ２ａ，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｕ－ｈｏｎｇ２ｂ，ＬＩＵ Ｓｈｉ－ｇｕｏ１
　　（１． Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ； 2ａ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；
　　2ｂ．Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｂｉｏ－Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ） ｉｎ ｒｉｃｅ ｗｅｒｅ ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｎｔｉ－ＴＬＲ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ＧＩＭＳＡ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＬＲ２， ９ ａｎｄ １１ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｔ ｄａｙ １０ ｗｅｒｅ ７０％， ０ ａｎｄ ０， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ ｗｅｒｅ ５５％， ６１％， ５８％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ５０％ ａｎｄ ５２％ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｔ was ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｂｙ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＴＬＲ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＬＲ９ ａｎｄ １１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ｉｔ was ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＴＬＲｓ ｗｅｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｔｉ－ｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｌａｒｉａ； ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ； TLRs； ａｎｔｉｂｏｄｙ
　　
　　疟疾是一种在热带和亚热带地区造成大量死亡的恶性传染病，以雌性按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）为传播媒介［１］。近年来由于在非洲和东南亚地区抗药性虫株的快速扩散使得全球抗疟的形势十分严峻［２］。在疟疾的死亡病例中，病人往往伴随着严重的炎症反应。深入了解疟疾的病理过程将有助于寻找新的药物靶点和开发新型的抗疟药物。Ｔｏｌｌ样受体（ＴＬＲｓ）是机体天然免疫的核心分子，与多种感染性疾病和自身免疫性疾病有着密切的关系［３］。目前ＴＬＲｓ家族已发现的成员有１０多个。其中，已有研究报道ＴＬＲ１１在弓形虫感染的过程中通过感知弓形虫的肌动蛋白抑制蛋白样蛋白而启动下游免疫反应，大幅提高ＩＬ－１２等促炎症因子的血清水平［４，５］。肌动蛋白抑制蛋白是一种在进化上非常保守的蛋白质［６，７］。弓形虫和疟原虫的这一蛋白质非常相似［８］，之前的研究已经证明在疟原虫的侵染过程中ＴＬＲ１１的ｍＲＮＡ水平大幅升高。除ＴＬＲ１１之外，ＴＬＲ２和ＴＬＲ９的ｍＲＮＡ水平也有不同程度的升高。但关于这些ＴＬＲｓ对疟疾病理进程的影响尚无报道。本研究通过抗体尾静脉注射的方法选择性地封闭小鼠不同的ＴＬＲｓ并以伯氏疟原虫（Plasmodium berghei Anka）感染小鼠，观察小鼠被抗体封闭后的病理变化，以期深入探讨ＴＬＲｓ在疟疾病理过程中的作用。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 动物模型的构建
　　１．１．１ 试验动物 ４～６周龄昆明小白鼠９０只，体重１８～２２ ｇ，购自新乡医学院动物中心；原生动物门伯氏疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ Ａnka），购自北京大学医学院寄生虫学教研室；ＴＬＲ２、９、１１抗体购自ＳＡＮＴＡ ＣＵＲＺ公司。
　　１．１．２ 感染小鼠 初次感染时，取１０只小鼠，然后从液氮中取出冻存的伯氏疟原虫（其保存于冷冻的小鼠外周血中），３７ ℃解冻复苏，每只小鼠腹腔注射含伯氏疟原虫的血液０．３ ｍＬ。待小鼠外周血被虫体感染的红细胞超过３０％后，摘除小鼠眼球取血，并加肝素抗凝。２ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，弃上清，并加入灭菌生理盐水，重新悬浮红细胞，并重复上述步骤，重复洗３次后，加入灭菌生理盐水并悬浮红细胞，用于再次感染试验用小鼠。
　　１．２ 分别封闭小鼠的ＴＬＲ２，９，１１
　　取４０只昆明小鼠，随机分为４组。取其中３组分别经尾静脉给每组小鼠注射ＴＬＲ２、９、１１抗体０．１ ｍＬ，每隔２４ ｈ注射１次，连续注射３次；其余１组设为对照组，并经尾静脉给每只小鼠注射兔ＩｇＧ抗体 ０．１ ｍＬ，每隔２４ ｈ注射１次，连续注射３次。在注射第一次抗体后将４组小鼠经腹腔注射感染伯氏疟原虫，观察各组小鼠红细胞的感染率和小鼠的存活率。
　　１．３ 感染率的检测
　　在小鼠感染伯氏疟原虫后每２４ ｈ取小鼠尾血１滴，滴在载玻片上推制薄血膜，室温晾干后用甲醇固定，用５％ＧＩＭＳＡ染液染色３０ ｍｉｎ。在油镜下观察薄血膜，并计数２ ０００个红细胞，计算感染率。
　　２ 结果与分析
　　２．１ 封闭ＴＬＲs对小鼠存活率的影响
　　试验用ＴＬＲ２、９、１１的抗体分别处理小鼠，封闭对应的ＴＬＲ，并随后给小鼠感染疟疾，并给对照组小鼠注射兔ＩｇＧ抗体，以排除抗体的非特异性结合的影响。由图１可知，ＴＬＲ９、１１抗体注射组小鼠分别于第10天和第9天全部死亡，对照组小鼠在第１０天有５０％存活，而ＴＬＲ２抗体注射组小鼠的存活率在第１０天达到７０％。与对照组相比，ＴＬＲ２抗体处理后小鼠的存活率明显上升；而ＴＬＲ９、１１抗体处理后小鼠的存活率明显下降（Ｐ＜０．０５）。
　　２．２ 封闭ＴＬＲs对小鼠的红细胞感染率的影响
　　由图２可知，ＴＬＲ２抗体处理的小鼠在第６天红细胞感染率达到峰值，为５５％；而ＴＬＲ９和ＴＬＲ１１抗体处理的小鼠红细胞感染率在初期会迅速上升，并分别在第６天和第４天达到峰值，分别为６１％和５８％。ＴＬＲ２抗体处理后小鼠的红细胞感染率与对照组相比没有明显变化，而ＴＬＲ９、１１抗体处理后小鼠的红细胞感染率明显上升，与对照组相比第２、３、４、５天的红细胞感染率存在显著差异（Ｐ＜０．０５）。
　　
　　３ 讨论
　　近期有研究表明，在ＭｙＤ８８和ＴＲＩＦ缺陷的小鼠中，感染疟疾后小鼠只有非常轻微的症状，通过这一结果可以判断，在疟疾的重症病例中，炎症反应给机体造成的伤害要远大于疟疾本身［９，１０］，通过抑制ＴＬＲ表达或抑制其二聚化作用而抑制炎症反应可能是降低恶性疟疾患者死亡率的一个途径。
　　在ＴＬＲ２抗体封闭之后，对小鼠的红细胞感染率没有明显的影响，但是显著地降低了小鼠的死亡率。这一结果显示，疟疾造成的死亡病理至少部分是由于机体自身的炎症反应造成的。有研究表明［１１］，当ＴＬＲ２被封闭之后，其下游的炎症因子如ＩＬ－６等的水平均会受到影响。而当封闭ＴＬＲ９或ＴＬＲ１１时，小鼠的感染率和死亡率均迅速升高。通过这些试验可以推测，ＴＬＲｓ对疟疾感染初期的宿主防御非常重要，通过对ＴＬＲｓ的选择性封闭，可以有效地影响小鼠模型的疟疾病理进程。ＴＬＲｓ是一类有潜力的抗疟药物或治疗辅助药物的靶点。本研究中发现不同的ＴＬＲ对不同的病理现象发挥作用，如ＴＬＲ２在被封闭之后影响了小鼠的死亡率，而ＴＬＲ９和ＴＬＲ１１被封闭之后则可同时影响小鼠的死亡率和感染率。
　　参考文献：
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　　［９］ ＥＲＤＭＡＮ Ｌ Ｋ， ＦＩＮＮＥＹ Ｃ Ａ， ＬＩＬＥＳ Ｗ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｌａｒｉａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ＴＬＲｓ ｓｈａｒｅ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ， ２００８，１６２（２）：１０５－１１１．
　　［１０］ ＹＡＭＡＭＯＴＯ Ｍ， ＳＡＴＯ Ｓ， ＨＥＭＭＩ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｄａｐｔｏｒ ＴＲＩＦ ｉｎ ｔｈｅ ＭｙＤ８８－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０１（５６３３）：６４０－６４３．
　　［１１］ ＪＡＮＧ Ｓ， ＵＥＭＤＴＳＵ Ｓ， ＡＫＩＲＡ Ｓ， ｅｔ ａｌ． ＩＬ－６ ａｎｄ ＩＬ－１０ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ＴＬＲ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００４，１７３（５）：３３９２－３３９７．

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