【褐蘑菇多糖的理化性质初步研究】银耳多糖的理化性质

　　摘要：用微波萃取法对褐蘑菇（Portobello mushroom）进行多糖提取并进一步纯化，观察了褐蘑菇纯化多糖的基础物理性质并测定了褐蘑菇多糖的水分、灰分、蛋白质及多糖含量；通过硫酸－咔唑反应、菲林试剂反应、碘－碘化钾反应等进行了理化性质的初步研究。结果表明，褐蘑菇纯化多糖的水分含量为１．１０％，灰分含量为１．３１％，多糖含量为７３．９0％，蛋白质含量为１．２５％、无糖醛酸、还原糖和淀粉。
　　关键词：褐蘑菇（Portobello mushroom）；多糖；提取；理化性质
　　中图分类号：Ｓ６４６．１＋１；ＴＱ９１４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－0981-02
　　
　　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉcochemical Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｔｏｂｅｌｌｏ Ｍｕｓｈｒｏｏｍ
　　
　　ＬＩＵ Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｉｅ
　　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ of Biology， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｕｘｉｎ １２３０００， Ｌｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Microwave extraction method ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ pｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｍｏｉｓｔｕｒｅ， ａｓｈ， ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ pｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ sulfate-carbazde reaction， fｅｈｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ， iodine-potassium reaction． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗed ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ were １．１０％ ｗａｔｅｒ， １．３１％ ａｓｈ， ７３．９0％ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ １．２５％ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ pｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ， ｎｏ ｉｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ， ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｈａd been ｄｅｔｅｃｔｅｄ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； extract； physicochemical ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
　　
　　多糖理化性质与其生物活性紧密相关，结构决定理化性质，从而影响其活性［１］。褐蘑菇（Portobello mushroom）是双孢蘑菇的近缘种，是欧美市场最畅销的食用菌名贵品种之一，其特点是菌盖丰满，肉质感强，被誉为“素牛排”。本试验用微波萃取法对褐蘑菇进行多糖提取并进一步纯化，然后对褐蘑菇多糖进行了水分、灰分、多糖及蛋白质含量的测定，通过硫酸-咔唑反应、菲林试剂反应、碘－碘化钾反应等进行了理化性质的初步研究，为进一步研究褐蘑菇纯化多糖的药理作用提供了理论依据，从而为开发褐蘑菇多糖保健品打下基础。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 材料
　　１．１．１ 试验材料及试剂 褐蘑菇由辽宁田园实业有限公司提供。乙醇、氢氧化钠、浓硫酸、氯仿、正丁醇、乙醚、苯酚、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝Ｇ－２５０、咔唑、酒石酸钾钠、碘、碘化钾等试剂购自沈阳国药集团。
　　１．１．２ 仪器与设备 Ｌ－５５０台式低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；ＲＥ－５２Ａ旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温真空干燥箱（上海南汇老港五金机械厂）；马弗炉（温州瓯海自动化仪表厂）；７２４－１型可见光分光光度计（上海光学仪器五厂）。
　　１．２ 方法
　　１．２．１ 褐蘑菇多糖的提取及含量测定 将褐蘑菇放入真空干燥箱５０～６０ ℃烘干至恒重，粉碎后过５０目筛，用微波萃取法［２］提取褐蘑菇多糖。经双氧水脱色、Ｓｅｖａｇｅ法脱蛋白得褐蘑菇纯化多糖。
　　采用苯酚－硫酸法［3］测定多糖含量。标准曲线的制作：准确称取１０５ ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品２０ ｍｇ，将其定容于５００ ｍＬ容量瓶中；准确吸取标准溶液０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ，用蒸馏水补至１．０ ｍＬ，加入５％苯酚０．６ ｍＬ，再加入浓硫酸３．６ ｍＬ，混匀后于沸水浴中加热３０ ｍｉｎ，冷却后在４９０ ｎｍ处测定吸光度值。以吸光度值为横坐标、葡萄糖质量浓度为纵坐标制作标准曲线，得回归方程ｙ＝１１．６７５ｘ－０．０３７（ｒ＝０．９９８ ７）。将提取的褐蘑菇多糖按照上述方法测吸光度值，根据回归方程计算葡萄糖含量，再换算成多糖含量。
　　１．２．２ 褐蘑菇多糖的理化性质
　　１）基础物理性质。提取的褐蘑菇粗多糖经纯化后，观察其颜色、状态、气味，取等量褐蘑菇纯化多糖分别溶于水、乙醇、乙醚、丙酮，观察溶解情况；取一定量褐蘑菇纯化多糖水溶液测定ｐＨ值。
　　２）水分和灰分含量的测定［4］。１００ ℃下常压烘干，称量，测定褐蘑菇纯化多糖的水分含量；灰分含量的测定采用马弗炉灼烧法。
　　３）蛋白质含量的测定。采用考马斯亮蓝法［５］测定蛋白质含量。称取１００ ｍｇ考马斯亮蓝Ｇ－２５０溶于５０ ｍＬ乙醇（体积分数为９５％）中，加入１００ ｍＬ浓磷酸（体积分数为８５％），最后加蒸馏水至１ ０００ ｍＬ；称取１０ ｍｇ牛血清白蛋白溶于１００ ｍＬ蒸馏水中，制成100 μｇ／mＬ的贮备液，再按一定比例配制成每毫升分别含２０、４０、６０、８０、１００ μｇ的蛋白质标准溶液。分别准确吸取１．０ ｍＬ各浓度标准溶液置于具塞刻度试管中，加入５．０ ｍＬ上述考马斯亮蓝Ｇ－２５０蛋白试剂，混匀，空白以蒸馏水代替，静置２ ｍｉｎ后在５９５ ｎｍ处测吸光度值。以吸光度值为纵坐标、蛋白质含量为横坐标制作标准曲线，得回归方程为ｙ＝７．４00ｘ＋０．５１６（ｒ＝０．９９７ １）。按上述方法测定褐蘑菇多糖的蛋白质含量。
　　４）硫酸－咔唑反应。糖醛酸与咔唑反应生成紫红色化合物，用硫酸－咔唑反应可以鉴别有无糖醛酸。①试剂配制。称取咔唑０．１２５ ｇ溶于 １００ ｍＬ乙醇（体积分数为９５％）中，置于棕色试剂瓶中４ ℃保存。②测量步骤如下：将含有１０～４０ μｇ褐蘑菇纯化多糖的水溶液２ ｍＬ缓慢加入盛有１２ ｍＬ浓硫酸的大试管中，置冰水浴中冷却，然后在沸水浴中加热１０ ｍｉｎ，冷却至室温，加入上述咔唑乙醇溶液０．４ ｍＬ，充分混匀，室温下放置３０ ｍｉｎ，观察有无紫红色化合物生成。
　　５）菲林试剂反应。菲林试剂反应常用来检测还原糖，由于还原糖中的还原性醛基可以将菲林试剂中的Ｃｕ２＋还原成Ｃｕ＋，从而生成红色沉淀。①菲林试剂的配制。试剂甲：称取ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ３４．５ ｇ溶于蒸馏水并稀释至５００ ｍＬ。试剂乙：称取氢氧化钠１２５ ｇ、酒石酸钾钠１３７ ｇ溶于蒸馏水并稀释至５００ ｍＬ。②测量步骤如下：分别取试剂甲和试剂乙各２ ｍＬ，混匀，加入含有１０～３０ ｍｇ褐蘑菇纯化多糖的水溶液1 ｍＬ，摇匀，沸水浴中加热１０ ｍｉｎ，观察有无红色沉淀生成。
　　６）碘－碘化钾反应。先配制２％碘化钾溶液，然后加入适量碘，使溶液呈淡棕黄色；取少量纯化多糖于点滴板上，加３～５滴稀碘液，观察颜色变化。
　　７）褐蘑菇多糖热稳定性的测定。称取５份２０ ｍｇ褐蘑菇纯化多糖，加沸蒸馏水1 ｍＬ溶解后，分别置于室温下及在４０、６０、８０、１００ ℃下烘干，观察其颜色变化情况，然后分别用１０ ｍＬ蒸馏水溶解，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液并定容至１０ ｍＬ，用苯酚－硫酸法［3］测定多糖含量。
　　２ 结果与分析
　　２．１ 褐蘑菇多糖的基础物理性质
　　褐蘑菇粗多糖为深褐色，粉末状。经脱色、脱蛋白、干燥处理得褐蘑菇纯化多糖为白色，粉末状，较易溶于水，但难溶于乙醇、乙醚、丙酮，其水溶液ｐＨ近中性。
　　２．２ 褐蘑菇多糖的水分、灰分、蛋白质及多糖含量
　　褐蘑菇纯化多糖的水分含量为１．１０％，灰分含量为１．３１％，蛋白质含量为１．２５％，多糖含量为７３．９0％。
　　２．３ 化学性质
　　硫酸－咔唑反应呈阴性，无紫红色化合物生成，表明褐蘑菇多糖中无糖醛酸；菲林试剂反应呈阴性，无红色沉淀生成，表明褐蘑菇多糖中无还原糖；碘－碘化钾反应呈阴性，表明无淀粉。
　　２．４ 褐蘑菇多糖的热稳定性
　　在相同烘干时间条件下，以室温放置的样品为对照，比较不同烘干温度的样品颜色变化以及多糖含量。结果表明，不同烘干温度下的样品颜色与室温时相同，在室温及４０、６０、８０、１００ ℃下，褐蘑菇多糖的吸光度值分别为０．９５３、０．９３１、０．９２２、０．９１０、０．８３２，多糖的吸光度随温度的升高略有下降，表明温度对褐蘑菇多糖的稳定性有一定影响。
　　３ 结论
　　１）用微波萃取法提取褐蘑菇粗多糖，后经双氧水脱色、Sｅｖａｇｅ法脱蛋白得褐蘑菇纯化多糖。褐蘑菇纯化多糖为白色，粉末状，较易溶于水，难溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂，其水溶液pＨ近中性。褐蘑菇纯化多糖的水分含量为１．１０％，灰分含量为１．３１％。
　　２）用苯酚－硫酸法测得褐蘑菇纯化多糖中多糖含量为７３．９0％，用考马斯亮蓝法测得褐蘑菇多糖中蛋白质含量为１．２５％。
　　３）硫酸－咔唑反应呈阴性，表明无糖醛酸；菲林试剂反应呈阴性，表明无还原糖；碘－碘化钾反应呈阴性，表明无淀粉存在。温度对褐蘑菇多糖的稳定性有一定影响。
　　多糖的活性与其结构和理化性质密切相关，并且这两个因素不是单一地影响多糖的活性，空间结构决定理化性质，进而影响其活性。因此，在研究多糖构效关系时，不仅要考察各级结构和理化性质分别对多糖活性的影响，还要研究二者交互作用对多糖活性产生的综合影响。本试验对褐蘑菇多糖的理化性质进行了初步研究，为褐蘑菇多糖的活性研究和深加工利用奠定了基础，关于褐蘑菇多糖的构效关系还有待进一步研究。
　　参考文献：
　　［１］ 张琳华． 桑叶多糖提取分离纯化工艺的研究及其结构性质的初探［Ｄ］． 天津：天津大学，２００５．
　　［２］ 赵富宝，刘 莹． 微波萃取褐蘑菇多糖的研究［Ｊ］．浙江食用菌，２００８，１６（６）：１７－１９．
　　［3］ 李 娜． 褐蘑菇多糖提取及含量的测定［Ｊ］． 光谱实验室，２００９， ２６（１）：４３－４６．
　　［4］ 刘 莹． 褐菇营养成分分析及玉米秸杆培养料研究［Ｄ］．长春：东北师范大学，２００７．
　　［５］ 李艳红． 山楂多糖的提取、分离纯化及结构研究［Ｄ］． 太原：山西大学，２００６．

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