TMB,表达水平对EGFR突变晚期NSCLC患者预后分析

高 峥，宋春青，张 颖，郭宏伟，司莲莲，赵丽波

(首都医科大学大兴教学医院 肿瘤科，北京102600)

肺癌在我国发病率和死亡率均居首位，并且发病率逐年增长，患者趋年轻化，预后也较差[1-2]。原发性肺癌中约80%为非小细胞肺癌(NSCLC)，随着致癌驱动基因如表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros癌基因1(ROS1)等的相继发现，基于驱动基因的靶向治疗药物大大延长了非小细胞肺癌患者的生存期。相比西方国家，亚裔人群和我国的NSCLC患者EGFR基因敏感突变阳性率更高，达40%-50%，其中不吸烟者、女性尤高[3]。因此，EGFR是肺癌治疗中最重要的靶点。一代、二代和三代 EGFR-TKI是目前EGFR 突变型IV期NSCLC患者的一线标准治疗方案，可以取得较高的客观缓解率(70%左右)和9-18个月的中位PFS，但仍有部分EGFR驱动基因阳性的患者疗效及预后不佳，因此，寻求此类患者TKI治疗获益的预测因子和标记物可对临床决策产生积极影响。

肿瘤突变负荷(TMB)是一个具有良好前景的全新生物标记物。TMB被定义为肿瘤基因组中每百万碱基中被检测出的，体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。多项研究提示，高TMB患者对免疫治疗应答更强，对肺癌[4]、黑色素瘤[5]等恶性肿瘤的免疫治疗均有预测作用。国外部分数据显示TMB数值的高低可能与EGFR驱动基因突变患者的预后相关，本研究采用回顾性研究，分析真实世界中晚期NSCLC患者治疗前TMB的表达水平及其与EGFR突变患者的预后相关性，揭示TMB是否在靶向治疗中亦存在预测作用。

1.1 一般资料

回顾性纳入2015年1月至2021年1月在首都医科大学大兴教学医院确诊的95例初治晚期NSCLC患者。组织学分类依据世界卫生组织标准(2015年版)[6]。肺癌分期按国际抗癌联盟(UICC)第8版TNM分期进行。研究方案经首都医科大学大兴教学医院伦理审查委员会批准。选择纳入标准：①经原发或转移病灶穿刺活检或手术切除组织病理确诊为肺腺癌或含腺癌成分的肺鳞癌，第8版国际抗癌联盟分期标准为Ⅳ期；
②年龄≥18岁；
③含EGFR驱动基因敏感突变(19DEL或21L858R)，且一线治疗给予EGFR-TKIs药物，用药时间至少30 d以上；
④患者诊断时已行组织TMB检测并可以获得完整的病历资料。主要排除标准：①合并其他原发性恶性肿瘤；
②无法获取病理组织、Ⅰ-Ⅲ期患者或合并严重并发症、心肝肾等严重脏器功能障碍有TKI药物治疗禁忌者。截止2021年1月，共纳入95例患者，其中男52例，女43例；
年龄(63.69±9.37岁)；
病理类型：腺癌92例，鳞癌1例，腺鳞癌2例。

1.2 方法

1.2.1EGFR-TKIs靶向治疗 所有患者一线治疗接受单药EGFR-TKI治疗，可选择吉非替尼250 mg(1片)，1日1次，或盐酸埃克替尼125 mg(1片)，1日3次，或甲磺酸奥希替尼80 mg(1片)，1日1次。直至患者肿瘤疾病进展或出现无法耐受的治疗毒性。最常见的毒副作用为皮疹、腹泻和药物性肝损伤，NCICTCAE2级或2级以上的ALT、AST升高，NCICTCAE3级或3级以上的腹泻、皮疹，允许暂停TKIs治疗至下降至0-1级后再次应用，出现药物相关的间质性肺疾病，重度肝损伤等重度毒性时给予终止TKI治疗并更换治疗方案。

1.2.2临床资料采集 从电子病历中提取患者的临床和治疗信息，包括性别、年龄、吸烟史、肿瘤分期、病理类型、具体治疗方案、无进展生存期等。根据实体肿瘤Recist 1.1版疗效评价标准，通过螺旋CT或磁共振成像扫描对所有患者进行影像学评价。无进展生存期(PFS)被定义为从首次用药到第一次疾病进展或因任何原因死亡的日期。采用门诊或电话随访，本研究最后一次随访时间为2022年3月1日。

1.2.3TMB检测 所有穿刺组织或手术切除组织离体后用中性缓冲福尔马林固定。为保证TMB检测结果的可靠性，要求送检3个月以内的蜡块组织。病理质控达标后，使用QIAGEN试剂盒从10至15张5 μm厚的肿瘤FFPE组织的未染色切片中提取基因组DNA。应用通用试剂盒KAPA Hyper Prep试剂盒进行DNA文库制备，然后采用定制的xGen锁定探针进行杂交富集，探测面板的设计目标是425个癌症特异性基因，采用目标区域探针捕获技术，在Illumina Hiseq4000 NGS平台上扩增富集的文库并进行NGS检测。TMB定义为每1Mb检测的基因组中的体细胞突变数，统计的突变包括错义、同义、移码、剪接位点突变，排除了EGFR和ALK等肺癌驱动基因的激酶结构域。

1.2.4统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用t检验和χ2检验。采用Kaplan-Meier方法对高TMB、中低TMB组的PFS进行生存分析，采用Cox比例风险模型对影响PFS的预后因素进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 TMB表达与临床病理特征的相关性

在纳入标准的95例EGFR突变的晚期NSCLC患者中，中位TMB值为5.2 muts/Mb(2.0-16.2 muts/Mb)，通过三分位法分为高TMB组(TMB>6.1 muts/Mb)、中TMB组(4.5-6.1 muts/Mb)和低TMB组(<4.5 muts/Mb)。其中高TMB组患者的ORR为59.38%(19/32)，显著低于中、低TMB组(ORR为84.13%(53/63))，χ2值7.086，差异有统计学意义(P=0.008)。21L858R突变患者51例，TMB均值为7.026±4.076 muts/Mb，19DEL突变患者44例，TMB均值为5.336±2.004 muts/Mb，21L858R突变患者TMB表达水平高于19DEL患者，差异有统计学意义(P=0.014)。大多数人为一代TKI治疗患者，其中吉非替尼组患者最多，占70.5%(67/95)，盐酸埃克替尼组其次，占25.3%(24/95)，三代TKI均为甲磺酸奥希替尼，占4.2%(4/95)。TMB表达水平与性别、年龄、是否吸烟、病理类型均无显著相关性(P>0.05)。

表1 TMB表达与临床病理特征的相关性

2.2 生存分析

Kaplan-Meier生存曲线分析显示，高TMB组的中位PFS为7.2m(95%CI 4.570-9.830)，中、低TMB组患者中位PFS为11.2m，(95%CI 10.300-12.100)，两组比较，差异有统计学意义(P=0.001)(图1)。与19DEL突变患者相比，21L858R突变患者中位PFS更短，为9.3m(95%CI 7.665-10.935)vs 11.2m(95%CI 9.550-12.850)，但二者无明显统计学差异(P=0.072)(图2)。

图1 高TMB与中、低TMB的PFS Kaplan-Meier生存曲线图

图2 21L858R突变患者与19DEL突变患者的PFS Kaplan-Meier生存曲线图

2.3 影响NSCLC患者PFS的预后因素分析

对可能影响预后的临床病理特征进行单因素和多因素回归分析(表2)。单因素分析显示以下3个因素与PFS有关：EGFR突变状态(P=0.031)、吸烟(P=0.038)、TMB表达水平(P=0.001)。多因素分析显示以下2个影响PFS的独立预后因素：吸烟(HR=1.838，95%CI：1.072-3.151，P=0.027)、TMB表达水平(HR=2.518，95%CI：1.468-4.319，P=0.001)。

表2 影响NSCLC患者PFS的单因素和多因素分析

既往研究证实TMB高与免疫治疗预后呈正相关[5、7-8]。2015年，Science发表了首个探索TMB与NSCLC免疫治疗疗效的研究[4]，该研究指出高TMB的NSCLC患者接受免疫治疗的临床获益持久率(DCB)明显高于低TMB患者，且不论PD-L1表达状态。多项大型临床研究，如CheckMate-026、CheckMate-22等也证实了高TMB患者在肺癌ICIs有效性增加。从机制上讲，TMB-H的肿瘤突变数量增加，这些癌细胞中异常基因编码的肽段可被细胞表面的主要组织相容物(MHC)加工和递呈，形成肿瘤新生抗原，并被机体内的T细胞识别，从而提高ICIs的治疗敏感性。研究表明，TMB在驱动基因阳性的患者显著降低[9]，可能原因为强势驱动基因突变抑制其他非同义突变的产生。而在靶向治疗中，有研究显示TKI耐药后患者TMB水平明显升高[10]，可能因为在靶向治疗的选择性压力下出现多样性亚克隆和耐药通路增加相关。

Offin等[10]评价了153名转移性非小细胞肺癌TMB水平对靶向治疗的预测价值，发现中、低TMB组的治疗终止时间(TTD)和总生存(OS)显著长于高TMB组，且低TMB组更多继发T790M突变，首次证实TMB与NSCLC患者接受EGFR-TKI治疗的临床获益呈负相关。作为第一个报道TMB与EGFR-TKI治疗预后的研究，这项研究靶向治疗未纳入三代TKI药物从而未能给出TMB对三代TKI疗效的预测作用，其次，研究者选择TTD作为疗效衡量指标，而未采用在评估药物疗效方面更有说服力的PFS。

臧远胜教授团队[11]筛选癌症基因组图谱中289例EGFR突变型NSCLC患者的基因突变和生存时间信息，结果显示高TMB组OS时间短于低TMB组(24.03个月vs未达到，P=0.0020)，是EGFR突变型晚期肺腺癌的独立不良预后因素，但是，该研究的数据源于TCGA数据库，无法获得具体治疗方案，因此无法给出TMB对EGFR-TKI疗效的预测价值。

目前尚没有公认的区分高、低TMB的cut-off值，考虑到诸多局限性因素，如：NGS公司众多，检测技术各有千秋，测序平台参数不尽相同，NGS panel、TMB计算方法也各有差异，使得各家的结果短期内难以统一化、标准化。肿瘤突变负荷应用于肺癌免疫治疗的专家共识[12]推荐各研究可根据各自临床研究数据确定cut-off值，并进行前瞻性验证。本研究参照一系列评价TMB在免疫治疗中的价值的经典文献，采用三分位法确定TMB cut-off值。本研究结果提示，相比高TMB组，中低TMB组患者接受靶向治疗后的ORR、中位PFS明显延长，提示预后更优。与19del突变患者相比，L858R突变患者TMB更高，中位PFS更短，为9.3m(95%CI 7.665-10.935)vs 11.2m(95%CI 9.550-12.850)，这与既往报道相符[13]。同时多因素分析发现吸烟患者的PFS更短，也是影响PFS的负向独立预后因素，可能与烟草暴露诱发基因突变增加相关。然而，本研究同样存在一定缺陷，包括：研究类型并非是具有更高级别循证医学证据的前瞻性研究，样本量较少，尤其三代TKIs病例数较少，不能了解是否三代TKI的应用可以改善高TMB患者的预后，且未同时纳入OS数据以分析中国人群与预后的关系等。由于NGS使我们能够全面了解非小细胞肺癌的遗传状况，因此在分析TMB与EGFR-TKIs临床益处的相关性时，可能将其他合并突变一并纳入并加以分析会更加客观。

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