推拿点按法对中风后肢体痉挛大鼠脑皮质中胶质细胞源性神经营养因子表达的影响

孙玮辰，孙嘉宝，卢龙嫚，汲广成，王宇峰，宋柏林

（长春中医药大学，长春 130117）

中风是一种由脑部缺血或出血引起的急性脑神经功能障碍疾病[1-3]。中风后肢体痉挛是中风发病后常见的并发症，约有30%～50%的中风患者出现肢体痉挛，并为日常生活、独立活动的主要障碍，故寻求神经保护及修护作用的卒中康复方法成为早期康复治疗的热点[4-8]。现代研究证实，推拿可改善缺血后神经功能，提高神经生长因子的表达，抑制凋亡，从而保护脑神经细胞，改善受损大鼠的运动及感觉功能[9]。本文通过观察推拿点按手法对胶质细胞源性神经营养因子在中风后肢体痉挛大鼠脑组织中表达的影响，进而探讨推拿抗中风后肢体痉挛的潜在作用机制。

1.1 实验动物 40 只SPF 级成年雄性SD 大鼠，体质量280～300 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号码：SCXK（吉）-2020-0002。室温22～26℃，湿度40%～60%，给予自然昼夜节律的光照，购入后自由饮水、摄食，持续性饲养1 周后进行实验，术前12 h 禁食不禁水。

1.2 造模方法 采用改良的Zea Longa 线栓法[10]对造模大鼠建立左侧大脑中动脉闭阻模型，按大鼠体重将配置好的10%水合氯醛根据麻醉给药标准以腹腔注射的方式进行麻醉，麻醉后将大鼠仰卧固定于抗干扰恒温加热鼠台上制备MCAO模型，术后皮下注射青霉素。假手术组仅需麻醉后分离神经与血管，充分暴露后无需挂线，进行缝合和青霉素注射。

1.3 动物分组及干预方法 40 只大鼠按随机数字表法抽取分成假手术组10 只，造模30 只（模型组和推拿组各15 只）。MCAO 模型术后24 h 进行Zealonga 评分和改良的Ashworth 评分[11]筛选中风后肢体痉挛大鼠模型，Zealonga 评分大于1 分且改良Ashworth 评分在I 级以上筛选入组，共入组20 只，随机分为模型组10 只和推拿组10 只。推拿组根据《实验动物腧穴图谱》[12]采取穴位点按刺激，选择头穴顶区，两侧夹脊穴及患侧曲池、阳陵泉，点按操作共计10 min，每日1 次，连续治疗7 d，假手术组与模型组不予治疗。

1.4 观察及检测方法

1.4.1 行为学检测 造模1 d 及8 d 后，采用神经功能缺损评分、改良Ashworth 评分和网屏试验对大鼠进行运动功能评分。

1.4.2 Tunel 染色 造模8 d 后取大鼠脑组织，将样本经4%多聚甲醛固定后，按照病理实验检测程序的步骤进行染色，在不同倍数下用显微镜观察大脑皮质组织损伤情况。

1.4.3 Western Blot Real-time PCR 造模8 d 后，取大鼠脑组织，液氮冷冻，-80℃保存。每组随机选取5 只大鼠，检测大鼠患侧脑皮质中GDNF、GDNFmRNA 表达的变化。GAPDH 为内参对照，引物序列见表1。

表1 GDNF GAPDH 引物信息

1.5 统计学方法 运用SPSS 26.0 对数据进行分析，计量资料用均值±标准差（±s）表示，组间分析用单因素方差统计分析，不符合正态分布时选取非参数秩和检验的方法。相关统计学图表应用GraphPad Prism软件绘制。

2.1 神经功能评分比较 见表1。

表1 神经功能评分比较（± s，n =10）

表1 神经功能评分比较（± s，n =10）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；
与模型组比较，△P ＜0.05

2.2 8 d 后行为学评分比较 见表2。

表2 8 d 后行为学评分比较（± s，n =10）

表2 8 d 后行为学评分比较（± s，n =10）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；
与模型组比较，△P ＜0.05

2.3 TUNEL染色情况 干预治疗取材后，如图1所示，假手术组大鼠脑皮质区未见凋亡细胞，与假手术组相较，模型组存在大量细胞凋亡情况；
与模型组比较，推拿组细胞凋亡情况有明显降低，见图1。

图1 TUNEL 染色情况

2.4 各组大鼠脑皮质中GDNF表达情况 见图2、图3。

图2 各组大鼠GDNF 蛋白相对表达量比较

图3 各组大鼠GDNF mRNA 表达水平比较

中风后肢体痉挛又称“仆击”“偏枯”等，病机多因中风后气虚血瘀，日久筋脉失养，治疗多以疏经通络，养肝柔筋为主。头为诸阳之会，且更接近病处，头穴顶中线及顶旁1 线主治腰以下活动功能障碍、麻木，顶旁2 主治上肢功能障碍[13]。研究表明，针刺或点按头穴可促进脑源性神经因子的表达，有助于脑皮质神经细胞及受损神经的恢复[14-15]。足太阳主筋所生病，且最邻近阳脉之海，点按背腧穴可激发阳气，调和脏腑。手阳明经合穴曲池与足三阳经筋之会阳陵泉相配，通经养血，疏肝柔筋，协同增效。研究表明曲池与阳陵泉可调控相关神经递质，减少梗死面积，改善皮层神经功能，恢复运动功能[16-18]。因此选取背腧穴、头穴及对穴相配合，可起到通经调形的作用。推拿点按疗法既结合穴位穴性治疗特点又可提前介入治疗的时间，因临床中风患者急性期的特殊性，推拿点按治疗安全性高、易于操作。

从神经系统层次对中风后肢体痉挛机制进行分析，主要是卒中后中枢神经系统受损致上运动神经元损伤而引起感觉和运动功能障碍[19]。中枢神经系统疾病损伤再生机制的研究与周围神经系统修复过程息息相关，相关研究运用RNA 测序技术分析了人类周围神经系统对损伤反应的整个转录组图谱，发现了3 641 个显著差异表达的基因，大多数与生长因子上调有关，其中最明显的是GDNF[20]。GDNF 是转化生长因子（TGF-β）超家族的成员，在中枢和外周神经系统发育过程中可调节神经元的存活、分化和生长，是培养神经元存活最有效的神经营养因子，在体内可有效减少小鼠面神经撕脱伤后运动神经元的丢失，在缺血、缺氧和氧化应激等病理条件下对成熟神经元的存活和恢复起着重要作用[21-23]。GDNF 可激活多种信号通路，通过控制Akt 途径和caspase 级联之间的平衡，对神经细胞具有保护作用，改善脑水肿，减少梗死体积，抑制运动神经元凋亡，且可预防轴突诱导的运动神经元萎缩[24-26]。

研究选取大脑中动脉闭阻模型，与其他文献中选用的光栓法及内囊注射法相比，模型存活率高、稳定性高、应用更广。研究通过相关评分筛选出中风后肢体痉挛大鼠，模型肢体存在不同程度的运动功能障碍，经推拿点按手法治疗后改善了肢体运动能力，减少神经损伤及细胞凋亡情况，说明推拿点按疗法可减少因神经元损伤而引起的运动功能障碍。通过Western blot与PCR 检测显示经过治疗可增加脑皮质内GDNF 蛋白及mRNA 的含量，进一步从分子水平说明了推拿点按调控神经损伤的机制。

综上所述，推拿点按法可有助中风后肢体痉挛大鼠运动功能的恢复，抑制凋亡，减缓神经损伤，提高GDNF 蛋白及mRNA 的表达，改善因神经损伤引起的运动功能障碍。

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