游泳运动对D—半乳糖致衰老大鼠学习记忆及伏隔核c—fos表达的影响

　　摘　要：目的：探讨8周游泳运动对注射D-半乳糖致雄性衰老大鼠空间学习记忆能力、血清睾酮及伏隔核c-fos　表达的影响。方法：30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（C）、衰老模型对照组（AC）和衰老模型训练组（AT），每组10只。检测血清睾酮，利用八臂迷宫测试大鼠空间学习记忆能力，采用免疫组织化学结合图像半定量方法对伏隔核c-fos　神经元的数量、面积及灰度进行测量和分析。结果：1）　与正常对照组比较，衰老模型对照组大鼠血清睾酮水平显著降低（P0.05）；与衰老模型对照组比较，衰老模型训练组　Nac　c-fos　免疫阳性细胞数量和阳性产物面积均增加（P0.05）。结论：游泳运动可提高老年大鼠的记忆能力，机理可能与长期游泳运动提高老年大鼠的血清睾酮水平及增强大脑伏隔核c-fos　的表达有关。
　　关键词：游泳运动；免疫；学习记忆；血清睾酮；伏隔核c-fos；D-半乳糖；脑衰老
　　中图分类号：G804.7　文献标志码：A　文章编号：1007-3612（2012）11-0065-06
　　Effects　of　the　Swimming　Exercise　on　Learning　and　Memory　and　c-fos　Expression　within　Nac　of　the　Aging　Rats　Induced　by　D-galactose
　　TANG　Wei1，　REN　Ying-hui2
　　（1.College　of　P.E.　&　Arts，North　University　of　China，Taiyuan　030051，　Shanxi　China；2.Shanxi　Medical　University，　Taiyuan　030001，　Shanxi　China）
　　Abstract：Objective：　To　explore　the　effects　of　the　8-week　swimming　exercise　on　learning　and　memory，　the　level　of　serum　testosterone，　and　expression　of　c-fos　within　nucleus　accumbens　（Nac）　of　brain　in　the　aging　male　rats　by　D-galactose.　Methods：　Thirty　SD　aged　rats　were　chosen　and　randomly　divided　into　3　groups：　the　control　group（C），　the　aging　model　control　group　（AC），　the　aging　model　training　group　（AT）.　Radial　maze　was　used　to　assessed　each　animal’s　capability　of　learning　and　memory，　the　level　of　serum　testosterone　was　examined，　and　c-fos　expression　within　Nac　was　detected　and　analyzed　by　using　ABC　immunohistochemical　technique　and　semi　quantitative.　Results：1）　Compared　with　the　C　group，　the　level　of　testosterone　of　blood　plasma　decreased　（P0.05）　in　the　AC　group；　Compared　with　the　AC　group，　the　amount　and　area　of　c-fos　within　Nac　obviously　increased　（P0.05）　in　the　AT　group.　Conclusion：　The　swimming　exercise　may　enhance　the　learning　and　memory　ability　of　the　aging　rats，its　mechanism　might　be　that　swimming　exercise　increase　the　level　of　serum　testosterone　and　reinforced　expression　of　c-fos　within　Nac　at　the　same　time. 　　Key　words：　swimming　exercise；immunity；　learning　and　memory；testosterone；Nac；c-fos；D-galactose；　brain　aging
　　长期的慢性运动可以延缓与衰老相关的精神运动功能减退，对学习记忆有良好的影响［1］，但是具体机制尚不清楚。现有的资料表明雄激素水平与老年认知功能有密切关系［2-3］。伏隔核（nucleus　accumbens，Nac）是基底前脑的一个较大的核团，伏隔核与脑内其他结构的复杂纤维联系决定了其功能的多样性。现在研究表明伏隔核具有行为调控、镇痛作用、参与精神分裂症的产生、药物成瘾、心血管活动的调节，近来研究表明伏隔核也参与学习记忆的调节［4］。随着分子生物学研究的深入，人们发现即刻早期基因c-fos在脑中参与神经元的信号转导与凋亡过程，与认知功能和记忆有关，c-fos基因的表达对长期记忆的保持是必须的［5］。因此本实验以大鼠大脑伏隔核为研究重点，观察D-半乳糖致衰老大鼠游泳运动8周后血清睾酮水平，测试大鼠空间学习记忆能力及伏隔核c-fos的变化，探讨游泳运动提高衰老大鼠记忆能力的可能机制。
　　1　材料及方法
　　1.1　动物及分组　雄性健康成年SD大鼠3月龄　30只，体重200～250　g，均由山西医科大学动物饲养中心提供，标准啮齿类饲料饲养，自由摄食和饮水，室温（20±2）℃，湿度（45±10）%。将30只大鼠随机分为3组：即正常对照组、衰老模型对照组及衰老模型训练组，每组10只。。
　　1.2　动物衰老模型的建立　大鼠够回后适应环境3　d，正常对照组按常规饲养，自由活动，每日颈背皮下注射1次生理盐水（100　mg/kg），共8周；衰老模型对照组及衰老模型训练组常规饲养，每日颈背皮下注射1次D-galactose（100　mg/kg），共8周。
　　1.3　试剂　睾酮放射免疫试剂（天津德普生物技术医学产品有限公司）；c-fos　测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
　　1.4　训练方案　正常对照组，衰老模型对照组不施加任何干扰因素，笼中自由饮食、饮水、自由活动。衰老模型训练组运动8周，运动负荷参照徐波等游泳训练方法略加改动［6］。衰老模型训练组够回后适应性训练3　d，正式实验时，大鼠前4周每周1-6（约9：00-11：00）进行60　min/次的无负重游泳训练，后4周训练每周递增15　min，共8周。
　　1.5　八臂迷宫实验程序　所有大鼠在第九周周一进行八臂迷宫实验。实验前大鼠先在迷宫中适应2　d，2次/d。适应时3～4只大鼠同时置于迷宫中，自由活动和摄取食物10　min，适应后进行每天2次的训练。每次训练中，八臂中只有四臂放置了食物（分别为1、2、4、7号臂），整个实验过程均维持此顺序。大鼠置于迷宫中央区，此时中央区四周用鼠门关住，15　s后将门打开并开启分析测试软件，测试定时10　min，大鼠可选择进入任意一臂，以摄取食物。大鼠进入有食物的臂且摄取了食物为1次正确选择；分析记忆的记录参数为错误选择的次数，重新进入放食物臂或第一次进入放食物臂而不摄取食物为工作记忆错误（working　memory　error，　WME），进入不放食物臂称为参考记忆错误（reference　memory　error，　RME），两者之和为总记忆错误（total　error，　TE）10　min后实验结束。
　　1.6　血清睾酮测试　行为测试结束后第二天，所有大鼠麻醉后心脏取血，低温离心分离血清，置于4℃冰箱保存，用放射免疫分析法测睾酮。
　　1.7　脑组织的取材与切片　行为测试后第二天，大鼠经2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物（50　mg/kg），打开胸腔，从心尖将穿刺针插入升主动脉，然后迅速剪破右心耳，300　mL冷生理盐水快速冲洗血管，随后灌入4%多聚甲醛（0.1　mol/L　PBS配制，pH　7.4）300　mL，进行前固定，再以10%　蔗糖PBS液灌入　300　mL，灌注结束后迅速取脑，取出放在4%多聚甲醛PBS溶液中4℃后固定2　h，再浸入20%蔗糖PBS溶液中4℃保存过夜。组织完全沉底后，脑冠状位连续冰冻切片，片厚40　μm，隔4张取1张。
　　1.8　ABC免疫组织化学染色　切片经0.5%　Triton　X-100　PBS液孵育（37℃）1　h，然后加入10%　山羊血清工作液孵育（37℃）1　h，加入c-fos血清第一抗体（兔抗鼠），37℃孵育5　h后，4℃再孵育36　h；随后加入生物素羊抗兔第二抗体，37℃孵育1　h；接着入卵白素生物素复合物中，37℃孵育40　min，以上各步骤均用0.01　mol/L　PBS（pH　7.2～7.4）5　min×3次充分漂洗3遍（每次5　min）；DAB呈色，缓冲液中止显色，用蒸馏水反复漂洗。0.2%明胶裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
　　1.9　图像分析和统计学处理　用数码生物显微镜（德国Leica）和江苏捷达形态学显微图像分析系统，参照大鼠脑立体定位图谱测定大鼠伏隔核的c-fos免疫阳性产物。每组大鼠各随机选取10张伏隔核c-fos的片子在10×40倍下进行测量，计数阳性细胞个数、阳性产物面积和灰度。采用SPSSl3.0进行统计分析，描述性资料采用平均数±标准差表示（M±SD），采用单因素方差分析法，检验水准a=0.05。
　　2　实验结果
　　2.1　大鼠血清睾酮测试结果　表1　结果显示：与正常对照组比较，衰老模型对照组及衰老模型训练组大鼠血清睾酮水平明显降低（P0.05）；进入不放食物臂的次数及总错误次数均增多（P0.05）；与衰老模型对照组比较，衰老模型训练组Nac　的　c-fos　免疫阳性细胞数量和阳性产物面积表达均增加（P0.05）。（表3，图3）
　　图3说明：　免疫组织化学方法结果显示衰老大鼠　Nac　c-fos免疫阳性神经元（箭头所示）数量及面积均明显减少；游泳运动8周后大鼠Nac　的c-fos　免疫阳性神经元数量、面积显着增多。
　　3　讨　论
　　3.1　游泳运动对雄性衰老大鼠血清睾酮水平及学习记忆能力的影响　下丘脑-垂体-性腺轴功能衰退是人类衰老的主要环节，人在进入老年期后由于血管硬化，供血不足等原因使睾丸发生逐渐萎缩或纤维化，睾丸间质细胞数量逐渐减少，细胞内脂褐素增多，加之睾丸组织促性腺激素受体数目减少，或敏感性下降，导致睾酮水平低下，而出现一系列临床症状，老年男性伴随生殖衰老所发生的雄激素减少不仅导致生殖功能减退，同时伴有不同程度的骨质疏松、学习记忆能力下降等症状［7］。本研究得出了相同的结果，与正常对照组相比，衰老模型对照组大鼠的血清睾酮水平显著下降，平均值下降148.91　ng/dL，下降幅度为56%，而经过8周的训练血清睾酮水平显著增加，尽管远低于正常对照组，但与衰老模型对照组相比显著增加，平均值增加71.12　ng/dL。
　　认知功能包括感知觉、记忆、注意、语言、思维、意识、情感、结构运用及高级执行能力、定向力和自知力等。认知功能随着年龄的增加有下降趋势，而老年人的性激素水平随着年龄的增加也有下降趋势，推测老年男性认知功能的减退可能与雄性激素水平的下降有关，其中睾酮是人们研究的热点。Salminen等研究了26名前列腺癌患者，平均年龄65岁，他们均接受睾丸去势手术，术前、术后6个月和12个月分别测定睾酮水平，同时进行认知功能测验。研究结果表明，睾酮下降导致患者视觉运动变慢，工作记忆的反应时间延长，觉醒测验正确反应率下降，延时再认、字母识别速度的成绩下降，这说明睾酮下降与认知功能相关［8］；Moffat等随访了407名50～91岁的健康男性10　a，结果发现游离睾酮较高男性的语词记忆（对所阅读或听过的语言材料加以识记，保持和再现的过程）、视觉记忆（对所见过的视觉材料如图片等加以识记，保持和再现的过程）和视觉空间能力（视觉-空间的分析和综合能力，如要求被试找出图片所画东西的缺失部分）成绩较好，这说明游离睾酮与中老年男性的某些特定认知功能呈正相关［9］。
　　学习与记忆是脑的高级功能之一，学习记忆力减退是脑衰老的普遍现象。D-半乳糖衰老模型是目前较常用的一种人工催老模型，具有衰老变化明显、模型稳定的特点。研究表明，大鼠连续注射D-半乳糖后可表现出与自然衰老相似的改变，而且D-半乳糖引起脑神经元的退行性变化而表现为学习记忆能力下降［10］。八臂迷宫已被公认为一种比较理想的学习记忆模型，动物通过观察周围一些固定的参照物，经过反复识认，从而在其脑内将参照物同空间方位联系起来，来学习和记忆自身与饵（置于迷宫臂末端的白色小食丸）的相对位置，获得辨别该空间方位的能力，是一种评估啮齿动物空间学习记忆能力的工具，已被广泛接受和应用［11］。在本实验中，参照既往文献，大鼠每日皮下注射D-半乳糖100　mg/kg连续8　周，与正常对照组比较，衰老模型对照组及衰老模型训练组均出现了记忆力减退的表现。运动作为一种抗衰老的手段已有近百年的历史，研究发现，长期的规律运动训练能够改善大鼠的空间学习记忆能力［12］，本实验得到了相同结果，与衰老模型对照组比较，经过8周游泳运动衰老大鼠重新进入放食物臂或第一次进入放食物臂而不摄取食物的次数、进入不放食物臂的次数及总错误次数显著减少，总错误次数减少5.08次，说明长期游泳运动可以改善老年大鼠脑组织形态和结构上的退行性变化，进而改善学习记忆能力下降及老年健忘等症状。本实验衰老大鼠经过8周游泳运动后血清睾酮水平增加，因此可以推断长期有氧运动增强大鼠记忆能力可能与血清睾酮水平的增加有关，关于睾酮改善老年大鼠学习记忆的作用机制，可能与睾酮影响突触可塑性、神经递质及神经兴奋性有关。
　　3.2　游泳运动对老年大鼠伏隔核c-fos　表达的影响伏隔核是边缘系统的一个重要神经核，它位于纹状体腹侧，是边缘系统与纹状体运动的接口，因此显示出它的重要性。实际上大脑皮层和海马等脑区的信息又汇总在伏隔核，更加突出伏隔核的重要地位［13］。研究发现伏隔核参与学习记忆的调节，Jeremy等通过利多卡因损害大鼠伏隔核，结果水迷宫测试可以削弱大鼠的空间记忆能力，得出结论伏隔核或许与海马相互作用影响大鼠的记忆［14］。证据表明：Nac　与空间记忆的巩固相关，例如阻止海马、纹状体及杏仁体到伏隔核的谷氨酸能通路导致大鼠八臂迷宫的参考记忆错误及工作记忆错误显著增多［15］。c-fos　基因通常被看作神经元激活的标志物，c-fos是原癌基因家族中一类可以被第二信使诱导的原癌基因，它们能对神经递质、激素等刺激作出反应进行表达，在体内相当于第三信使的作用，它与学习、记忆及运动调控密切相关。研究表明，即刻早期基因c-fos　的表达和蛋白质合成是LTP　能够维持数周乃至数月的物质基础［16］。J.　He等研究发现，即刻早期基因c-fos、c-jun及其基因产物的异二聚体调节其他基因的转录，是短暂刺激引起突触连接长期变化的中介，说明原癌基因c-fos、c-jun对于编码空间记忆是必要的［17］。国内王虹等让大鼠在Y-迷宫中进行学习记忆训练，然后应用免疫细胞化学方法检测　c-fos　在纹状体边缘区的表达，结果表明，大鼠进行Y-迷宫厌暗学习时，纹状体边缘区内的即刻早期基因的c-fos　参与学习记忆的信号传导过程［18］。 　　本研究结果显示：衰老模型对照组伏隔核c-fos显著减少，与Balog等研究结果一致［19］，可能是由于伏隔核衰老神经元接受刺激的反应性减低所致，而衰老模型训练组大鼠游泳运动8周后即刻伏隔核内c-fos阳性细胞及面积明显增多，提示老年大鼠长期游泳运动提高学习记忆能力可能与伏隔核内c-fos表达增强有关，但是伏隔核内c-fos增强的机制仍不清楚。可能由于长期有氧运动使兴奋性氨基酸大量释放，导致Ca2+内流［20］，胞内钙离子浓度升高时，与钙调蛋白（CaM）结合形成Ca/CaM复合物，对转录因子进行磷酸化修饰，从而启动　c-fos即刻早期基因的表达［21］；而且游泳运动可引起脑内许多神经元突触前膜多巴胺等单胺类神经递质浓度增高［22］，这些神经递质作为细胞间传递信息的第一递质，作用于突触后膜的相关受体，伏隔核内含大量多巴胺能受体、5-羟胺能受体都是与核苷酸环化酶耦联的受体，对细胞内环腺嘌呤核苷酸（cAMP）有上调作用［23］，进而激活c-fos基因表达；上调的cAMP进一步促进谷氨酸合成及递质释放；谷氨酸再作用于突触后天门冬氨酸（NMDA）及非NMDA受体，使突触后神经元兴奋产生长时程增强效应，继而激活即刻早期基因c-fos［24］，shimizu　等认为NMDA受体的激活是LTP诱导环节上最为关键的一步［25］。
　　一系列研究发现：大脑核团海马、纹状体、伏隔核等c-fos　神经元表达较多，这些区域可检测到很多雄激素受体（AR），而睾酮都是通过雄激素受体（AR）作用于它们的靶器官来发挥其生物学效应［26］。Bittman　通过研究去势大鼠给予睾酮替代治疗发现，睾酮能明显升高脑组织中AR免疫阳性细胞的数量［27］。因此我们可以推断，雄性大鼠衰老后由于外周雄激素的下降，引起伏隔核雄性激素含量下降，从而使伏隔核AR　含量下降，导致c-fos基因表达减少，而游泳运动通过增加伏隔核雄激素水平而上调c-fos　表达，从而增强衰老大鼠的学习记忆能力。另外，研究认为睾酮还可能通过改善内皮细胞功能扩张脑动脉［28］，改善脑供血而起到改善学习记忆的作用，Azad等研究发现睾酮补充治疗可以加强中脑、前上部脑回等部位的大脑血流灌注，从而为睾酮改善认知功能提供了客观依据［29］。
　　本实验衰老大鼠通过长期游泳运动血清睾酮水平显著增加，伏隔核c-fos　阳性神经元的数目和面积均明显增高，提示长期游泳运动可能通过增加睾酮水平、调节神经递质、增强c-fos　活性，从而增强衰老大鼠的学习记忆能力，具体机制有待于进一步研究。
　　4　结　论
　　1）衰老大鼠机体血清睾酮水平显著下降，记忆力显著减弱，长期游泳运动可以增加血清睾酮水平，从而增强衰老大鼠的记忆能力。
　　2）衰老大鼠Nac　中c-fos　的表达显著减少，长期游泳运动可以增强伏隔核c-fos　的表达，参与学习记忆的信号传导，从而增强衰老大鼠的记忆能力。
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