关于“使用血球计数板对酵母菌进行计数”的问题探讨_血球计数板计数酵母菌

　　摘要：“培养液中酵母菌种群数量的动态变化”是新课标教材“必修3：稳态与环境”中的学生分组实验，需要学生学会使用血球计数板进行准确计数酵母。通过结合“培养液中酵母菌种群数量的动态变化”这一实验和有关血球计数板的命题的分析，对血球计数板的计数原理和操作方法中遇到一些问题进行探讨。
　　关键词：血球计数板 生物学实验 实验操作
　　中图分类号：G633.91
　　文献标识码：B
　　在人教版高中生物教材中，“探究培养液中酵母菌种群数量变化”只作了基本的原则性指导，对一些操作过程的细节，没有作细化阐述，而这些细节都是实验成功的关键所在。
　　如何正确使用血球计数板对酵母菌种群数量进行计数，是本实验的重点和难点。根据中学实验条件，用显微镜直接计数法相对容易，只要指导学生掌握血球计数板的正确使用便可。但学生对血球计数板结构的认识不够明确，教师也讲解不清晰。而在近年来的高考题或模拟题中多次出现相关的试题，而且不仅从如何计算酵母的数量的角度来考查学生，还从操作方法或操作过程中出现的一些问题以及处理方法来考查学生。而教师在遇到这些问题往往让学生记答案，学生对这些问题仍是感到疑惑。笔者在近年来的教学实践中，将教师和学生在做该实验和相关命题遇到的一些问题，进行了分析探讨。
　　1 血球计数板的构造和计数原理
　　虽然不同版本的教材推荐使用的血球计数板的规格不同，人教版建议使用2mmx2mmx0.1mm方格，苏教版推荐使用1mmx1mmx0.1mm方格，但是血球计数板的使用原理和方法是相同的。以下以1mmx1mmx0.1mm方格的计数板为例分析结构和计数原理。
　　每个血球计数板上有两个计数室（图1）。血球计数板上的符号和数字（图1）的含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板中计数室分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2（计数室边长1mm），分400个小格，每小格面积是1/400mm2（图2），9个大方格中只有中间的有小方格的中央大方格才是计数室。不要认为9个大方格都是计数室。
　　计数室通常也有两种规格：一种是16x25型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格（图2）；另一种是25x16型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16x25=25x16=400个小方格组成。
　　计数时，若计数室是由16个中方格组成，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100个小方格）的菌数。如果是由25个中方格组成的计数室，除数上述4个中方格外，还需数中央1个中方格（即80个小格方）的菌数（图3）。计数时对压在中格四条线上的细胞只计数相邻两边及其夹角上的细胞（一般选左边和上边的线）。
　　以1minx1mmx0.1 mm方格的计数板为例，如果是25个中格的计数室，计数的5个中格菌数共N个，那么1mL培养液中菌数=N/5x25x10000x稀释倍数。如果是16个中格的计数室，计数的4个中格菌数共N个，那么1mL培养液中菌数=N/4x16x10000x稀释倍数。
　　2 血球计数板操作方法的注意事项
　　教师在介绍血球计数板的操作方法时，往往是比较简略的。学生在操作中因为对操作要求不理解而造成操作不当，或者对操作中出现的异常问题的处理不知如何处理。而通过分析近几年的有关血球计数板的相关试题，更注重操作方面的考查，而教师在这方面对学生分析阐述得少。
　　（1）在取样计数前，为什么要将酵母菌培养液进行振荡摇匀？
　　因为这样使酵母菌分布均匀，防止酵母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，减小培养液中的酵母菌数量误差。
　　（2）为什么要先在计数室上盖上盖玻片，再滴加菌液？
　　通常滴加菌液时，采用的是“渗入法”：先将盖片盖住计数室，盖片的两端应搭放在计数室两侧的支持柱上。从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多，一般将滴管口沿盖片边缘与计数平台之间的空隙轻轻靠一靠即可），让菌悬液渗入并充满计数室，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去多余菌液。技巧：用吸水纸吸去多余的培养液时要迅速，保证计数室被培养液充满，以减少误差。
　　但也可采用“压滴法”：先将适量菌液滴加在计数平台上，再将盖片从一侧压到计数扳上，使盖片搭放在两则支持柱上，将菌液滴压平。不管用哪种方法，都必须把握3个原则：加入待测菌液后，计数室内不能产生气泡；不能将菌悬液沾到盖玻片表面，以免污染显微镜的高倍镜头；不能将菌液沾到计数平台两侧的支持柱表面。比较而言，渗入法更容易操作。
　　（3）如果先滴加菌液，再加盖玻片，容易出现什么误差？怎么处理？
　　如果先滴加菌液，再加盖玻片（压滴法），容易使菌液沾到计数平台两侧的支持柱表面，在支持柱表面形成一层水膜而使盖片不能完全落在支持柱上。盖玻片由于液滴的表面张力作用而未能严密的盖到计数板表面上，使计数室内的体积增大，计数结果将偏高。应将血球计数板和盖玻片洗净、烘干重做。
　　（4）如果计数室中出现气泡，会出现什么误差？怎么处理？
　　如果计数室中出现气泡，会使盖玻片下有部分空间没有充满菌液，是待计数的菌液体积减少，导致结果偏小。应将血球计数板和盖玻片洗净、烘干重做。也就要重新制片。
　　为什么不采用在盖玻片一侧滴加菌液，另一侧用吸水纸吸引的“引流法”？这是因为通过引流法，将盖玻片下方的液体可以进行置换，可能会去除部分气泡，但很难除尽气泡。引出的菌液会带走部分细胞，造成误差。菌液也容易沾到盖玻片表面，污染显微镜的高倍镜头而看不到目标。
　　（5）血球计数板应该如何正确清洗？
　　血球计数板使用结束后，应采用清水浸泡和冲洗的方式清洗，并进行烘干或自然晾干或用吹风机吹干。不能使用试管刷等硬物进行擦洗。镜检每个小格中是否存有污物、残菌，如不清洁，需重新清洗直至洁净。 　　这是因为血球计数板的方格线非常精细、脆弱，当用试管刷擦洗时会造成线条磨损。也不能用普通的餐巾纸等进行拭擦，可能磨损线条，也会在计数室中留下纸纤维等污物。要用专用的拭镜纸轻轻擦拭。另外在使用血球计数板前需要在显微镜下检查，不干净要清洗烘干再使用。
　　（6）使用显微镜下进行计数，要注意哪些问题？
　　①血球计数板加样后，需静置片刻再使用显微镜计数。这是因为计数室中的菌悬液有一定的高度（0.1mm）。需要让细胞沉降到计数室底部的网格线中，避免细胞分布在不同液层深度，导致计数时被遗漏。
　　②先在低倍镜下，找到网格，也就是要先找到计数室（有小网格的部分）。将第一个计数中格移到视野中心，再换高倍镜逐小格观察并计数。观察时还应安排一个顺序，比如，依次按照左上中格、左下中格、右下中格、右上中格。若有第五中格时，当计数到右上中格时，先向左移动两个中格，再往下移动两个中格便是最中间的一个中格。小格的观察顺序最好是从左到右，从上到下逐格进行。计数时压线的细胞本着计上不计下，计左不计右的原则，以免重复计数。
　　活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数；若芽体小于母细胞一半时为一个酵母细胞。
　　③因为生活酵母细胞的折光率和培养液的折光率相近，所以观察时要减弱光照的强度，将视野调暗些。但不能太暗，否则也看不清。
　　④每个样品计数应重复3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），取其平均值。
　　（7）如果细胞数目过多，难以数清，应该采取什么措施？
　　如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应该进行稀释，然后再进行计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5～10个菌体为宜。
　　稀释时要注意：将1mL样液稀释10倍，不是加10mL无菌水，而是加9mL无菌水，即加水稀释后的体积是原来的10倍。这点不仔细就很容易分析错。例如将1mL样液稀释100倍，就应该加99mL水。而不是90mL水。
　　（8）能不能区分活酵母细胞和死酵母细胞，避免计数出现较大误差？
　　探究“酵母菌种群数量变化”，理应为培养液中活菌体的数量变化，人教版教材中没有提出活菌和死菌的分开计数问题。易理解成用总的菌体数作计数结果；苏教版教材中虽建议用台酚蓝染液染色，但没有说明这是对活菌（无色）和死菌（蓝色）的区分，并且是将染液直接滴在血球计数板上，菌液浓度改变，造成误差。正确的做法应是另外制作装片，通过染色对活菌和死菌加以区分，算出两者比例，进一步换算出总菌体数中的活菌数。由于台酚蓝染液配制相对复杂，且台酚蓝有一定致癌性，建议用吕氏碱性美蓝（亚甲蓝）染液对酵母菌染色，活的酵母细胞呈无色，死的或代谢衰弱的酵母细胞呈蓝色。

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